冉 琴，張 雷，張 沄，邱玉環(huán)，袁謝芳，王孝蕓，唐紅梅，王 星，李國(guó)平

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

根據(jù)發(fā)病機(jī)制哮喘可分為輔助性T淋巴細(xì)胞2(T-helper lymphocyte type-2, Th2)型和非Th2型，相應(yīng)的氣道炎癥也存在著不同的亞型[1]，在非Th2型重癥哮喘患者中發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主。然而，中性粒細(xì)胞性哮喘與哮喘的急性發(fā)作、控制不佳和重癥哮喘等有關(guān)，并且對(duì)激素的治療效果欠佳，甚至出現(xiàn)“激素抵抗”反應(yīng)[2-3]。目前，如何有效治療中性粒細(xì)胞性哮喘是臨床急需解決的重要難題，因此尋找新的藥物用于治療中性粒細(xì)胞性哮喘具有重要意義。白藜蘆醇是多酚類化合物，存在于多種植物中[4]，具有多種生物活性，其是公認(rèn)的具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用和癌癥化學(xué)預(yù)防劑[5-6]。研究[7]表明：在人群中觀察到白藜蘆醇攝入與肺功能成正相關(guān)關(guān)系，即攝入白藜蘆醇可以增加用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的水平。越來越多的證據(jù)[8-9]表明：白藜蘆醇對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用，如急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺纖維化等肺部疾病。然而，國(guó)內(nèi)外至今尚無白藜蘆醇改善中性粒細(xì)胞性哮喘氣道炎癥的研究報(bào)道。本研究擬通過建立中性粒細(xì)胞性哮喘模型，探討白藜蘆醇對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘的作用及其可能的作用機(jī)制，為臨床上治療中性粒細(xì)胞性哮喘尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 24只無特殊病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)C57BL/6J雌性小鼠購(gòu)自重慶騰鑫科技公司，周齡6～8周，體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、卵白蛋白(ovalbumin, OVA)、白藜蘆醇(resveratrol, Res)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司， 白細(xì)胞介素17(interleukin-17, IL-17)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京誠(chéng)林生物科技有限公司，丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技研究所，BCA蛋白分析試劑盒和活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技公司。小鼠肺功能儀購(gòu)自美國(guó) Buxco公司，全光譜分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司，離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司，低溫超速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó) Eppendorf公司，正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus公司，光學(xué)顯微鏡病理圖像分析儀購(gòu)自德國(guó)Leica公司，低溫恒溫水浴槽購(gòu)自上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取18只C57BL/6J雌鼠作為實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建制備中性粒細(xì)胞性哮喘模型，再隨機(jī)分為3組： LPS+OVA組、Res組和NAC組，每組6只。同時(shí)選取6只同周齡C57雌鼠作為對(duì)照組(PBS組)。Res組小鼠于激發(fā)前2 h灌胃給予30 mg·kg-1白藜蘆醇，NAC組小鼠于激發(fā)前2 h灌胃給予3 mg·kg-1NAC，LPS+OVA組和PBS組僅給予等體積生理鹽水，各組小鼠給藥體積均為0.2 mL。所有小鼠造模前均在相通環(huán)境(12 h/12 h 明暗周期，60%～70%濕度及飲水飲食可自由獲取)下飼養(yǎng)1周。

1.3 中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠模型的建立 中性粒細(xì)胞性哮喘造模方法參照文獻(xiàn)[10]。采用腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)麻醉小鼠，于實(shí)驗(yàn)開始的第0、1、2、7和14天用LPS (10 μg) 滴鼻聯(lián)合OVA (75 μg) 腹腔注射致敏實(shí)驗(yàn)組小鼠，PBS組小鼠致敏藥物用生理鹽水代替，方法及劑量同實(shí)驗(yàn)組。于實(shí)驗(yàn)的第15天起，實(shí)驗(yàn)組小鼠于麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入0.1% OVA溶液50 μL，每天1次，連續(xù)激發(fā)7 d，PBS組給予等體積生理鹽水滴鼻。末次激發(fā)后24 h檢測(cè)小鼠氣道阻力，48 h處死小鼠。

1.4 小鼠氣道阻力檢測(cè) 最后一次滴鼻激發(fā)小鼠后24 h，即第22天用乙酰甲膽堿依次按0、6.25、12.50、25.00和50.00 g·L-1遞增的濃度霧化小鼠，并采用肺功能儀對(duì)小鼠進(jìn)行氣道阻力的測(cè)定，每個(gè)濃度下的反應(yīng)時(shí)間為3 min，取每個(gè)濃度反應(yīng)期間的增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause,Penh)均值作為評(píng)價(jià)氣道高反應(yīng)(airway hyperresponsiveness, AHR)的指標(biāo)。

1.5 小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的收集及檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第23 天行腹腔注射致死劑量戊巴比妥鈉處死小鼠并分離氣道，22G留置針氣管插管并固定，結(jié)扎主支氣管，0.8 mL PBS灌洗肺3次(回收率≥80%時(shí)為合格)，收集BALF，1 500 r·min-1、4℃離心10 min。取上清-80℃保存，溶液激用于ELISA檢測(cè)。用1 mL PBS重懸細(xì)胞，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.6 小鼠肺組織病理切片HE染色 取左肺組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋后行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織中的炎癥情況，并采用HE染色切片半定量方法評(píng)定支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度[11]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無炎癥細(xì)胞(0分)；少許炎癥細(xì)胞(1分)；較多分布不均的炎癥細(xì)胞(2分)；大量炎癥細(xì)胞，分布較均勻，少見聚集成團(tuán)(3分)；大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)(4分)。

1.7 小鼠肺組織中ROS和MDA水平檢測(cè) 取出右肺組織，將一葉肺包埋行冰凍切片(切片厚度為4 μm)，按試劑盒說明書中步驟進(jìn)行ROS檢測(cè)，于熒光顯微鏡下觀察肺組織內(nèi)的熒光強(qiáng)度。將剩余肺組織于冰上進(jìn)行手工勻漿：先取組織塊在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，放入5 mL勻漿管中，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)，后按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用全光譜分光光度計(jì)進(jìn)行MDA的測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠吸入不同濃度乙酰甲膽后的氣道阻力 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠在霧化期間出現(xiàn)呼吸急促和打噴嚏等表現(xiàn)，且各濃度下的Penh值均明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠的哮喘癥狀明顯改善，各濃度下的Penh值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠吸入不同濃度乙酰甲膽堿后Penh值

Tab.1 Penh values of mice after inhalation of methacholine at different concentrations in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.2 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 與PBS組比較，LPS+OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)(total cells, TC)、中性粒細(xì)胞(neutrophil, NEU)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(eosnophils, EOS)均明顯增加(P<0.01)。與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組BALF中TC、NEU和EOS明顯減少(P<0.05或P<0.01)。各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞均以中性粒細(xì)胞為主。見表2。

表2 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

Tab.2 Total number of cells and inflammatory cell classification and count in BALF of mice in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.3 HE染色觀察各組小鼠肺組織形態(tài)及炎癥表現(xiàn) PBS組小鼠氣道上皮細(xì)胞排列整齊，周圍無或少量炎癥細(xì)胞，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡內(nèi)無或存在少許炎癥細(xì)胞；LPS+OVA組小鼠氣道上皮明顯增厚，氣道周圍存在大量聚集成團(tuán)的炎癥細(xì)胞，肺泡壁結(jié)構(gòu)大量破壞，肺泡內(nèi)存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Res組和NAC組小鼠氣道上皮增厚較LPS+OVA組明顯減弱，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞明顯減少，氣道周圍和肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見圖1(插頁一)。與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠肺組織炎癥評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠肺組織炎癥評(píng)分明顯降低，但明顯高于PBS組(P<0.01)。各組小鼠肺組織炎癥評(píng)分見表3。

2.4 ELISA法檢測(cè)各組小鼠BALF上清中IL-17水平 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠BALF上清中IL-17水平明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組BALF上清中IL-17水平明顯降低，但高于PBS組(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠肺組織炎癥評(píng)分和BALF上清中IL-17水平

Tab.3 Inflammation scores of lung tissue and IL-17 levels in BALF supernatant of mice in various groups (n=6,±s)

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBS group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with LPS+OVA group.

2.5 各組小鼠肺組織中ROS水平 與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠氣道及肺泡中ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠氣道及肺泡中ROS熒光強(qiáng)度明顯減弱。見圖2(插頁一)。

2.6 各組小鼠肺勻漿中MDA水平 PBS組小鼠肺勻漿中MDA水平為(1.66±0.10)μmol·mg-1，LPS+OVA組小鼠肺勻漿中MDA水平為(3.90±0.23)μmol·g-1，與PBS組比較，LPS+OVA組肺勻漿中MDA水平明顯升高(P<0.01)；與LPS+OVA組比較， Res組小鼠肺勻漿中MDA水平[2.77±0.07)μmol·g-1]和NAC組小鼠肺勻漿中MDA水平[(2.39±0.09)μmol·g-1]明顯降低(P<0.01)，但較PBS組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

白藜蘆醇主要來源于花生、紅葡萄酒、虎杖和桑葚等植物。許多研究[12-13]已證實(shí)：白藜蘆醇具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，其最主要的生物作用是抗氧化、抗炎、雌激素作用、抗癌以及癌癥化學(xué)預(yù)防活性。在腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病等方面白藜蘆醇已得到廣泛應(yīng)用，目前也將其應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的研究。研究[14-15]表明：白藜蘆醇對(duì)支氣管哮喘具有治療作用，其機(jī)制可能與抑制哮喘的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究采用白藜蘆醇干預(yù)中性粒細(xì)胞性哮喘具有一定的可行性。

本研究結(jié)果表明：白藜蘆醇對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠肺組織損傷具有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)：①降低小鼠AHR和BALF中的炎癥細(xì)胞及上清中細(xì)胞因子；②減輕肺組織的炎癥反應(yīng)；③降低肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。本研究中小鼠肺組織HE染色顯示：白藜蘆醇可明顯降低肺組織氣道及肺泡炎癥，改善氣道壁增厚。同時(shí)，為了進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠肺組織炎癥的影響，本研究分析了小鼠氣道炎癥指標(biāo)(AHR、炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和IL-17)，其中IL-17 為Th17細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，認(rèn)為其為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的一個(gè)觸發(fā)者[16]，因此測(cè)定IL-17的水平可以反映組織的炎癥浸潤(rùn)程度。本研究結(jié)果顯示：與LPS+OVA組比較，Res組小鼠AHR、炎癥細(xì)胞和IL-17均明顯降低，表明白藜蘆醇可減輕中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。

ROS是外源性氧化劑或細(xì)胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的含氧合物的總稱，在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為中起到重要作用[17]。氧化應(yīng)激是哮喘炎癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，ROS與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)有關(guān)，是導(dǎo)致呼吸道炎癥的重要介質(zhì)[18]。多項(xiàng)研究[18-21]表明：吸入不同的變應(yīng)原均可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，在動(dòng)物模型中過量的ROS產(chǎn)生還可引起AHR、組織損傷和重塑，因此抑制體內(nèi)ROS反應(yīng)具有重要意義。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，由多不飽和脂肪酸(PUFA)通過化學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)產(chǎn)生，為硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)的原型，常作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記，即脂質(zhì)過氧化[22]。白藜蘆醇具有抗氧化作用，本文作者推測(cè)：白藜蘆醇可以通過抗氧化作用抑制中性粒細(xì)胞性哮喘的炎癥反應(yīng)。ROS和MDA均可反應(yīng)組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平，本研究結(jié)果顯示：與PBS組比較，LPS+OVA組小鼠肺內(nèi)ROS和MDA表達(dá)水平升高，提示該組小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈；與LPS+OVA組比較，Res組和NAC組小鼠肺內(nèi)ROS和MDA水平明顯降低，提示白藜蘆醇可以通過抗氧化作用抑制小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，白藜蘆醇對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體的作用通路還有待進(jìn)一步研究。