韓寧寧，于曉輝，戴青，于麗娜，趙暉，楊秀玉

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

阿維菌素(avermectin)是1975年從阿維鏈霉菌中分離得到的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合物，因其高效、低毒的殺蟲活性而被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)上[1]。目前，我國(guó)是阿維菌素唯一生產(chǎn)國(guó)[2]，獲原料藥生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)的企業(yè)達(dá)16個(gè)。但由于其穩(wěn)定性欠佳，一直未收錄至《中國(guó)獸藥典》，目前其標(biāo)準(zhǔn)收載于農(nóng)業(yè)部公告第1960號(hào)中，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)阿維菌素殘留溶劑并未進(jìn)行相應(yīng)控制。其制備工藝的主要?dú)埩羧軇榧状?，本研究擬采用氣相色譜法建立阿維菌素殘留溶劑檢測(cè)方法，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 氣相色譜儀：Agilent 7890A，配氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；電子天平：METTLER AX205；離心機(jī)：Thermo Biofuge Stratos。

1.2 藥品與試劑 甲醇來(lái)源/批號(hào)：Merck/1060074008；阿維菌素原料藥來(lái)源：河北威遠(yuǎn)動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

2 方 法

2.1 色譜條件 采用Agilent DB-624毛細(xì)管柱，柱編號(hào)125-1334/USA302214H，固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.53 mm×3 μm。進(jìn)樣口溫度220 ℃。檢測(cè)器溫度250 ℃。載氣：氮?dú)狻Ａ魉? mL/min。進(jìn)樣量0.2 μL。分流比：10∶1。程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持5 min，以每分鐘15 ℃的速率升溫至80 ℃，再以每分鐘26.7 ℃的速率升溫至240 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取甲醇約0.15 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL置離心管中，精密加水2 mL，精密加內(nèi)標(biāo)溶液(取異丙醇0.5 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度)1 mL，混勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品約0.12 g，精密稱定，置離心管中，加間二甲苯2 mL使溶解。精密加水2 mL，混勻，離心。取出上層液再精密加水2 mL萃取一次。合并兩次萃取的水層液，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，離心去掉上層剩余間二甲苯，取水層作為供試品溶液。

2.2.3 回收率供試品溶液的制備 取供試品約0.24 g，精密稱定，置離心管中，加間二甲苯4 mL使溶解。加甲醇約12 mg，精密稱定，混勻。精密加水4 mL，混勻，離心。取出上層液再精密加水4 mL萃取一次。合并兩次萃取的水層液，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，離心去掉上層剩余間二甲苯，取水層作為回收率供試品溶液。

2.2.4 定量限溶液的制備 取甲醇約0.15 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL置離心管中，精密加水2 mL，精密加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，混勻，作為定量限溶液。

2.2.5 線性溶液的制備 取甲醇適量，精密稱定，用水稀釋制成濃度分別為0.015、0.15、0.3、0.6、1.2、3、6 mg/mL的溶液，作為線性溶液。將上述線性溶液照對(duì)照品溶液“精密量取2 mL……”處理后進(jìn)樣。

3 結(jié)果與分析

3.1 專屬性 對(duì)照品溶液色譜圖(圖1)中，甲醇峰與內(nèi)標(biāo)異丙醇峰的分離度為12.2，符合《中國(guó)獸藥典》[3]2015年版一部附錄殘留溶劑測(cè)定法分離度應(yīng)大于1.5的要求；理論塔板數(shù)按甲醇峰計(jì)為14410，亦符合主峰塔板數(shù)應(yīng)不低于5000的要求。供試品溶液色譜圖(圖2)中，除甲醇峰、異丙醇峰外，還有萃取殘存的間二甲苯峰，其與異丙醇的分離度為70.2，亦符合要求。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖Fig 1 The chromatography of the standard solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig 2 The chromatography of the sample solution

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 以甲醇峰面積與異丙醇峰面積的比值為(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)甲醇濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.3142x-0.0188，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明甲醇在0.006～2.4 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 定量限 以甲醇峰信噪比S/N約為10的甲醇濃度作為定量限。此時(shí)甲醇濃度為6 μg/mL。

3.4 回收率 該方法甲醇的平均添加回收率為90.8%，RSD為1.4%。添加回收率損失了10%左右，表明兩步萃取過(guò)程使甲醇產(chǎn)生了損失，但仍符合《中國(guó)獸藥典》[3]獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則關(guān)于待測(cè)成分含量0.1%左右回收率限度為90%～108%的要求(表1)。

3.5 重復(fù)性 對(duì)上述阿維菌素原料藥進(jìn)行6次甲醇含量測(cè)定，結(jié)果平均為0.3%，RSD為3.0%，亦符合《中國(guó)獸藥典》[3]獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則關(guān)于待測(cè)成分含量0.1%左右重復(fù)性限度為3%的要求(表2)。

3.6 耐用性 對(duì)該方法進(jìn)行了柱溫起始溫度±5 ℃、流速±0.5 mL/min、進(jìn)樣口溫度±10 ℃、檢測(cè)器溫度-10 ℃及更換不同內(nèi)徑的色譜柱等方面的耐用性進(jìn)行了考察，結(jié)果參見表3。在上述各耐用性考察條件下，甲醇理論塔板數(shù)均符合《中國(guó)獸藥典》[3]2015年版一部附錄殘留溶劑測(cè)定法應(yīng)不低于5000的規(guī)定，甲醇與異丙醇的分離度均符合大于1.5的規(guī)定。

表1 甲醇添加回收率測(cè)定結(jié)果Tab 1 The results of the recovery rate of added methanol

表2 甲醇含量重復(fù)性測(cè)定結(jié)果Tab 2 The results of the repeatability of methanol content

表3 方法耐用性結(jié)果Tab 3 The results of method durability

4 討論與結(jié)論

4.1 色譜柱的選擇 由于伊維菌素是阿維菌素的衍生物，二者在溶解性質(zhì)等方面具有相似性，故本方法在建立過(guò)程中參考了《中國(guó)獸藥典》[3]一部伊維菌素殘留溶劑檢查方法。上述方法測(cè)定目標(biāo)物為乙醇與甲酰胺，采用的色譜柱為聚乙二醇(PEG-20M)毛細(xì)管柱。在建立阿維菌素中甲醇?xì)埩羧軇┑臋z查方法過(guò)程中，考慮聚乙二醇為強(qiáng)極性色譜柱填料，同為強(qiáng)極性的甲醇在該柱上保留欠佳，峰形拖尾嚴(yán)重，故將聚乙二醇毛細(xì)管柱更換為中等極性的DB-624毛細(xì)管柱，以增加保留與改善峰形。

4.2 檢測(cè)器溫度的選擇 上述方法檢測(cè)器溫度為280 ℃。而本方法將色譜柱更換為DB-624柱后，該色譜柱的最大耐受溫度為260 ℃，故將檢測(cè)器溫度降低為250 ℃，以避免對(duì)色譜柱填料產(chǎn)生不可逆的損壞。

本試驗(yàn)所建立的阿維菌素殘留溶劑氣相色譜檢查方法簡(jiǎn)單易行，耐用性良好，可用于阿維菌素原料中甲醇?xì)埩羧軇┑臏y(cè)定，彌補(bǔ)了原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中該項(xiàng)的空白。