陳曉林，陸春波，陳慧華，林仙軍，包愛(ài)情

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

二氟沙星是畜禽專用的第三代喹諾酮類藥物，又名雙氟沙星，由美國(guó)Abbott公司在1984年研制，其鹽酸鹽制劑已經(jīng)在國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床上有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。鹽酸二氟沙星常用于敏感細(xì)菌如大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄菌、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌等引起的畜禽慢性呼吸道病、氣管炎、腸炎、肺炎、禽霍亂、鏈球菌病、傷寒等疾病，尤其對(duì)雞的大腸桿菌病，仔豬紅、黃、白痢有特效[3-4]。二氟沙星結(jié)構(gòu)如圖1所示，因在喹諾酮環(huán)的N1位引入4-氟苯基，抗菌譜擴(kuò)大，抗革蘭陽(yáng)性菌尤其是鏈球菌和銅綠假單胞菌的活性進(jìn)一步增強(qiáng)，并改善了藥物動(dòng)力學(xué)特征，相對(duì)減小了對(duì)幼年動(dòng)物的軟組織的損傷和毒副作用。在C7位引入甲基哌嗪，增加了抗革蘭陽(yáng)性菌的活性，改善了對(duì)酶的拮抗作用[5]。鹽酸二氟沙星粉，收錄于農(nóng)業(yè)部公告1960號(hào)[6]，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)其鑒別和含量進(jìn)行測(cè)定。但該方法專屬性較差，通過(guò)比較農(nóng)業(yè)部1960號(hào)收錄的二氟沙星制劑，恩諾沙星制劑及諾氟沙星制劑的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)三者最大吸收波長(zhǎng)非常接近。因此，通過(guò)紫外方法測(cè)定鹽酸二氟沙星粉中二氟沙星的含量，方法專屬性較差，易受到不法企業(yè)非法添加的恩諾沙星或者諾氟沙星等化合物的影響。二氟沙星與恩諾沙星、諾氟沙星等比較，原料價(jià)格較高。農(nóng)業(yè)部于2015年發(fā)布了2292號(hào)公告[7]，公告規(guī)定自2015年12月31日起，停止生產(chǎn)用于食品動(dòng)物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑，涉及的相關(guān)企業(yè)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)同時(shí)撤銷。在抽檢的樣品中發(fā)現(xiàn)了檢出諾氟沙星的鹽酸二氟沙星粉樣品。恩諾沙星使用廣泛，價(jià)格低廉且未被禁用，雖未發(fā)現(xiàn)有使用恩諾沙星替代其他喹諾酮類藥物的實(shí)例，但亦有較大潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)專屬性更強(qiáng)的液相方法，對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量，打擊不法企業(yè)弄虛作假有重要意義。當(dāng)前涉及到二氟沙星含量檢測(cè)的方法多集中在動(dòng)物組織中[8-10]，對(duì)鹽酸二氟沙星制劑中二氟沙星含量測(cè)定的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文對(duì)鹽酸二氟沙星粉中二氟沙星含量檢測(cè)的液相方法進(jìn)行了研究，開(kāi)發(fā)了高效液相色潽法測(cè)定鹽酸二氟沙星粉中二氟沙星的含量，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖1 二氟沙星結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式Fig 1 Structural formula of difloxacin

1 材 料

1.1 儀器 Aglient 1260 高效液相色譜儀，配安捷倫二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Aglient公司； XS-205電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。鹽酸二氟沙星對(duì)照品(來(lái)源：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0401204，含量：99.6%)；恩諾沙星(來(lái)源：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0081505，含量：99.5%)；環(huán)丙沙星(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130451-201203，含量：84.2%)；氧氟沙星(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130454-201206，含量：99.5%)；諾氟沙星(來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130450-201206，含量：99.5%)；鹽酸二氟沙星粉供試品1(規(guī)格5%)，由X廠生產(chǎn)；鹽酸二氟沙星粉供試品2、3(規(guī)格5%)，由Y廠生產(chǎn)；鹽酸二氟沙星粉供試品4(規(guī)格5%)由Z廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 喹諾酮類藥物的紫外相似性 喹諾酮類藥物由于其結(jié)構(gòu)較為相似，紫外光譜圖往往也較為相似，農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告中收載的三種喹諾酮制劑鑒別均為紫外-可見(jiàn)分光光度法，最大吸收波長(zhǎng)差值均在2 nm以內(nèi)，見(jiàn)表1，故僅通過(guò)紫外光譜圖或者最大吸收波長(zhǎng)來(lái)判斷可能會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。

表1 喹諾酮類藥物最大紫外吸收波長(zhǎng)Tab 1 The maximum ultraviolet absorption wavelength of quinolones

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect CSH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：磷酸溶液(取磷酸3.0 mL，加水至1000 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0±0.1，加乙腈50 mL，下稱磷酸溶液)-甲醇(78∶22,V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；掃描波長(zhǎng)：210～400 nm，記錄273 nm的色譜圖；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸二氟沙星對(duì)照品25.65 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，超聲使溶解，冷卻至室溫，用水稀釋并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(含二氟沙星約500 μg/mL)。精密量取適量，用磷酸溶液稀釋成50 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液 分別精密稱取恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星對(duì)照品25.89、22.92、24.08、25.27 mg置50 mL量瓶中，各加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，超聲使溶解，冷卻至室溫，用水稀釋并定容至刻度，各喹諾酮藥物濃度均約500 μg/mL。精密量取上述喹諾酮溶液與對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液5 mL置同一50 mL量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，即得。

2.3.3 供試品溶液 精密稱取供試品適量(約相當(dāng)于二氟沙星25 mg)，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，超聲使溶解，冷卻至室溫，用水稀釋并定容至刻度。精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 5種喹諾酮類藥物在試驗(yàn)條件下完全分離，分離度均大于2.1，各化合物的色譜峰理論塔板數(shù)均大于7000，方法專屬性良好。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液色譜圖及相應(yīng)對(duì)照品光譜圖見(jiàn)圖2。

2.4.2 線性范圍 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用磷酸溶液稀釋成2，5，10，25，50，100 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，方程為：Y=103.72X+5.33(R2=0.9999)，線性范圍為2～100 μg/mL。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)，二氟沙星濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。鹽酸二氟沙星對(duì)照品溶液(50 μg/mL)色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果，二氟沙星峰面積的RSD為0.1%，表明儀器精密度良好。

圖2 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖(A)及氧氟沙星對(duì)照品光譜圖(B)、諾氟沙星對(duì)照品光譜圖(C)、環(huán)丙沙星對(duì)照品光譜圖(D)、恩諾沙星對(duì)照品光譜圖(E)、鹽酸二氟沙星對(duì)照品光譜圖(F)Fig 2 Chromatogram of (A) system suitability and spectrograms of (B) ofloxacin reference substance (C) norfloxacin reference substance (D) ciprofloxacin reference substance (E) enrofloxacin reference substance (F) difloxacin hydrochloride reference substance

圖3 鹽酸二氟沙星對(duì)照品溶液(50 μg/mL)色譜圖Fig 3 Chromatogram of difloxacin hydrochloride reference substance solution (50 μg/mL)

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(供試品1)，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積，二氟沙星峰面積的RSD為0.4%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(供試品1)，照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中二氟沙星的含量。結(jié)果測(cè)得二氟沙星的含量均值為占標(biāo)示量的105.4%，RSD為0.2%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的鹽酸二氟沙星粉(供試品1，規(guī)格5%，含量為占標(biāo)示量的105.1%)0.25 g，共9份，置50 mL量瓶中，按高(120%)、中(100%)和低(80%)三個(gè)濃度水平分別添加鹽酸二氟沙星對(duì)照品，制得向已知含量制劑中添加已知測(cè)定物的添加樣品，每個(gè)濃度水平的添加樣品分別制備3份，照2.3.3項(xiàng)方法制備。測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n=9)Tab 2 Results of recovery test (n=9)

2.4.7 耐用性 在選定的色譜條件下，比較了Waters XSelect CSH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Aglient Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，結(jié)果表明兩者均可使5種喹諾酮藥物分離良好；對(duì)溫度進(jìn)行了考察，在本文優(yōu)化的流動(dòng)相下選擇溫度為25 ℃和35 ℃時(shí)，除出峰時(shí)間發(fā)生微小變化外，其余變化很?。粚⒘鲃?dòng)相中磷酸溶液與甲醇的比例調(diào)整為75∶25和81∶19進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微調(diào)也僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。綜上所述，不同品牌的色譜柱、不同流動(dòng)相有機(jī)相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗(yàn)需要，方法耐用性較強(qiáng)。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 取不同的鹽酸二氟沙星粉供試品，按2.3.3項(xiàng)下方法處理，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品制備2份，計(jì)算樣品中二氟沙星的含量，取平均值。供試品1與供試品2色譜圖及供試品2主峰光譜圖見(jiàn)圖4。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)供試品2和供試品3中未檢出二氟沙星而檢出諾氟沙星，并將供試品2和供試品3主峰光譜圖與諾氟沙星對(duì)照品光譜圖比對(duì)，確認(rèn)為諾氟沙星。同時(shí)將本文方法與農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告中收載的紫外方法進(jìn)行比較，見(jiàn)表3。

圖4 供試品1(合格供試品)色譜圖(A)、供試品2(異常供試品)色譜圖(B)及供試品2主峰光譜圖(C)、諾氟沙星對(duì)照品光譜圖(D)Fig 4 Chromatogram of (A) sample 1 (a qualified sample) (B) sample 2 (an abnormal sample) and spectrograms of (C) the main peak in sample 2 (D) norfloxacin reference substance

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量/%，n=2)Tab 3 Results of content determination of samples (labelled amount/%, n=2)

2.6 薄層色譜法鑒別鹽酸二氟沙星粉中的二氟沙星 分別稱取氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和鹽酸二氟沙星對(duì)照品各50 mg，加5 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液使溶解，加水稀釋至10 mL。取供試品適量，用水稀釋成含二氟沙星每1 mL中5 mg的溶液。取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-苯-二乙胺-水(15∶20∶10∶7∶4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視(薄層鑒別方法參照農(nóng)業(yè)部公告1960號(hào)鹽酸二氟沙星粉標(biāo)準(zhǔn)中鑒別1)，如圖5。二氟沙星與恩諾沙星在上述薄層色譜條件下，斑點(diǎn)比移值(Rf)極為接近，難以分辨，而二氟沙星與其他氟喹諾酮?jiǎng)t相對(duì)容易區(qū)分。

圖5 薄層色譜圖(1.氧氟沙星溶液；2.諾氟沙星溶液；3.環(huán)丙沙星溶液；4.恩諾沙星溶液；5二氟沙星溶液；6.供試品1(合格樣品)；7.供試品2溶液(含諾氟沙星)； 8.供試品3溶液(含諾氟沙星))Fig 5 Thin-layer chromatograms of 1. ofloxacin solution, 2. norfloxacin solution, 3. ciprofloxacin solution, 4. enrofloxacin solution, 5. difloxacin hydrochloride solution, 6. Sample 1 solution(a qualified sample), 7. Sample 2 solution(a sample contains norfloxacin), 8. Sample 3 solution(a sample contains norfloxacin)

3 結(jié) 論

在波長(zhǎng)選擇上，農(nóng)業(yè)部公告1960號(hào)鹽酸二氟沙星粉標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定供試品在273 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此，本文選用該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相優(yōu)化上，本文參考了農(nóng)業(yè)部公告2448號(hào)[11]中《氟苯尼考粉和氟苯尼考預(yù)混劑中非法添加氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星檢測(cè)方法》，對(duì)其流動(dòng)相中磷酸溶液和甲醇比例進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，使檢測(cè)效率更高。

將本文開(kāi)發(fā)的液相方法與農(nóng)業(yè)部公告1960號(hào)中紫外方法進(jìn)行比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示兩者在測(cè)定合格樣品中二氟沙星含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果基本一致。但在針對(duì)使用諾氟沙星乃至其他喹諾酮類化合物替代本品中的二氟沙星時(shí)，液相方法具有顯著優(yōu)勢(shì)，可輕易發(fā)現(xiàn)使用其他喹諾酮類藥物替代二氟沙星的情況。由于恩諾沙星與二氟沙星在紫外光譜方面無(wú)法區(qū)分，而在薄層色譜中又與二氟沙星非常接近，因此，使用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鹽酸二氟沙星進(jìn)行檢測(cè)時(shí)如遇見(jiàn)使用恩諾沙星替代二氟沙星的情況，有可能會(huì)將假藥誤判成合格樣品。

本文開(kāi)發(fā)的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，能夠有效的控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)提供了研究基礎(chǔ)。