杜吉革，朱真，薛麒，趙俊杰，彭小兵，張秀坤，李啟紅，印春生，姚文生，康凱，陳小云

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患菌[1-3]，不僅威脅著人類的健康，而且對畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-6]。根據(jù)該菌產(chǎn)生毒素的種類，可分為A、B、C、D、E五個毒素型[7]。其中，對養(yǎng)牛業(yè)危害最大的是A型，由于病牛往往無任何前驅(qū)癥狀，突然發(fā)作死亡[8-9]。因此，疫苗免疫是防制該病的有效手段。在預(yù)防羊的產(chǎn)氣莢膜梭菌病方面，雖然產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗，達到了一定的效果，但該類疫苗制備過程冗雜，抗原成分復(fù)雜，有效抗原量較低。如大劑量的肌肉注射會破壞牛肉的品質(zhì)。因此，提供安全、純凈、有效的抗原對未來預(yù)防該菌感染具有重要意義。

成熟的α毒素由N-末端和C-末端兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[10]，是一種依賴于Zn2+的金屬酶。其中，第56位和第130位的天冬氨酸是Zn2+結(jié)合位點，以上兩個氨基酸位點的突變能夠明顯降低α毒素的活性[11]。Alberto等[12]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y275N和 D336N的溶血活性只占野生型毒素的11%，細胞毒性則分別降為野生型毒素的十萬分之一和千分之一。在亞單位疫苗的研制中，增加Th細胞表位和佐劑能夠提高疫苗的免疫原性。口蹄疫病毒VP4蛋白的第20-35位氨基酸被證實是一種良好的Th細胞表位[13]。此外，細菌的鞭毛蛋白(flagellin)作為免疫佐劑能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生更強的體液免疫與細胞免疫應(yīng)答[14]。

為了降低因單個氨基酸突變在大規(guī)模生產(chǎn)中生物安全隱患，通過A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(C57-1株)CPA的56、130、275和336位氨基酸位點進行突變，同時引入VP4蛋白的Th細胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸(FN)的編碼序列，通過原核系統(tǒng)表達并純化重組蛋白，并對其毒力和免疫原性進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株天然毒素、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清及pET-30a(+)(以下簡稱pET)均為中監(jiān)所保存；1.5～2.0 kg普通級日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細胞Top10和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科(seppic)公司；Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒、蛋白Marker、Western blot Marker，均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)購自東洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優(yōu)化 以前期獲得的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株CPA編碼基因為模版進行密碼子優(yōu)化并引入D56G、D130G、Y275N和D336N等4個氨基酸突變。此外，在突變基因5'端添加VP4蛋白的Th細胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸的編碼序列，在突變基因3'端添加6*His標簽蛋白編碼序列。由中美泰和公司人工合成基因片段GTFNCPAm4。

1.3 CPA原核表達載體的構(gòu)建 以GTFNCPAm4為模板，采用引物對1F/1R進行PCR擴增。其中上游引物1F序列為：5'- CCCGGATCCATGTCCATAATC-3'，引入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基；下游引物1R序列為：5'-CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGG，引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基。PCR體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。

回收目的條帶，采用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切消化后，與經(jīng)過相同酶切消化的pET載體連接。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。對所提質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送中美泰和公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pTFNCPAm4。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定 將質(zhì)粒pTFNCPAm4和空載體pET分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，并分別在15 ℃和37 ℃的條件下用IPTG誘導(dǎo)表達，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，并以BSA蛋白為標準，利用灰度掃描的方法進行相對表達量和可溶性比例的統(tǒng)計，將表達的重組蛋白稱為rTFNCPAm4。采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，對rTFNCPAm4做進一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化及Western blot鑒定 對獲得的包涵體進行純化和復(fù)性，參照文獻[15]方法進行操作，最終獲得純化蛋白rTFNCPAm4。

1.6 純化蛋白的鑒定 純化復(fù)性后的rTFNCPAm4(0.5 μg)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶10000)為二抗進行孵育，按照底物顯色試劑盒說明進行顯色，檢測純化的rTFNCPAm4與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清的反應(yīng)情況。

1.7 重組蛋白的毒力測定

1.7.1 體外毒性檢測 制備卵黃瓊脂平板，分別取10倍濃縮的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素、天然毒素原液、肉干胃酶消化湯和rTFNCPAm4各10 μL 點于平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)1 h[16]。

制備1%的綿羊紅細胞懸浮液，分裝于EP管中，500 μL/管。分別取50 μL 的rTFNCPAm4及10倍系列稀釋的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素，加入裝有綿羊紅細胞懸浮液的EP管中，37 ℃溫箱培養(yǎng)1 h后靜置一段時間。同時設(shè)置肉肝胃酶消化湯、蛋白溶解液和dd H2O作為對照[17]。

1.7.2 體內(nèi)毒性檢測 將16～18 g ICR小鼠隨機分為6組，每組5只。分別以1 μg(5.5×101μg/kg)、10 μg(5.5×102μg/kg)以及100 μg(5.5×103μg/kg)三個注射劑量尾靜脈注射rTFNCPAm4，同時設(shè)置肉肝胃酶消化湯和蛋白溶解液作為陰性對照以及1個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的陽性對照。樣品用明膠緩沖液進行稀釋，注射的液體總體積為200 μL，觀察24 h，記錄小鼠的存活狀態(tài)。

1.8 免疫原性分析

1.8.1 免疫程序 選用對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價為0的家兔，進行重組蛋白rTFNCPAm4的免疫[15]。

1.8.2 血清中和抗體效價測定 采用血清中和的方法測定兔血清的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素中和效價[15]。

1.8.3 攻毒試驗 二免后21 d，對免疫組及對照組所有家兔通過耳緣靜脈各注射1個MLD劑量的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據(jù)免疫組及對照組家兔的死亡情況，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結(jié) 果

2.1 CPA突變體原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用引物1F/2R進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)酶切后克隆至pET載體上。獲得的重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果見圖1，酶切后出現(xiàn)大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約1527 bp的目的基因片段，與預(yù)期相符。測序結(jié)果表明，插入的外源基因序列正確，將此質(zhì)粒命名為pTFNCPAm4。

1: DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準; 2: pTFNCPAm4的BamHⅠ和XhoⅠ的雙酶切鑒定1: DL5000 DNA Marker; 2: pTFNCPAm4 digested with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ圖1 重組原核表達質(zhì)粒pTFNCPAm4的酶切鑒定Fig 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pTFNCPAm4

2.2 CPA突變體的原核表達鑒定 將pTFNCPAm4以及pET分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞并誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果顯示，BL21(DE3)菌體在15 ℃和37 ℃的條件下，rTFNCPAm4均以包涵體的形式表達(圖2A)，分子量約為58 kD，且能與抗His標簽抗體發(fā)生反應(yīng)(圖2B)，與預(yù)期相符?？紤]到誘導(dǎo)時間，我們確定rTFNCPAm4最適誘導(dǎo)表達條件為37 ℃，誘導(dǎo)表達4 h，收獲裂解后的沉淀蛋白，用于后續(xù)的純化。

2.3 rTFNCPAm4的純化與鑒定 如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒說明書對以包涵體形式表達的rTFNCPAm4進行純化，收集純度較高的Lane 5～9洗脫液進行透析和復(fù)性，最終獲得的蛋白濃度為0.85 mg/mL。將純化后的rTFNCPAm4經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，rTFNCPAm4能夠與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清反應(yīng)(圖4)。

2.4 rTFNCPAm4的毒力測定

2.4.1 rTFNCPAm4在檢測范圍內(nèi)無卵磷脂酶和溶血活性 在37 ℃溫箱培養(yǎng)1 h后，可見卵黃瓊脂平板上10倍濃縮的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素和毒素原液均出現(xiàn)特異的水解卵黃產(chǎn)生的乳濁反應(yīng)現(xiàn)象，而肉肝胃酶消化湯和純化后的rTFNCPAm4沒有出現(xiàn)上述現(xiàn)象(圖5)。

在37℃溫箱培養(yǎng)1h后靜置，可見101～105倍稀釋的天然毒素使綿羊紅細胞發(fā)生完全溶血，rTFNCPAm4及肉肝胃酶消化湯、蛋白溶解液及ddH2O對照組均無溶血現(xiàn)象(圖6)。

2.4.2 rTFNCPAm4對小鼠的毒力檢測 結(jié)果如表1所示，rTFNCPAm4注射組，以及蛋白溶解液、肉肝胃酶消化湯2個陰性對照組小鼠，在注射后24 h均存活，未見任何異常，而注射1個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素后，小鼠在24 h內(nèi)全部死亡，說明rTFNCPAm4已成功減毒，在檢測范圍內(nèi)對小鼠無致死性。

A.重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定；B.重組蛋白與抗His單抗反應(yīng)的Western blot M1. 蛋白Marker；M2. Western blot Marker；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)；pET. pET 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；1. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；2. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；pET 1.pET，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；pET2. pET，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀；3. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；4. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀；5. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；6. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀A.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE;B.The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot M1.protein Marker; M2. Western blot Marker；PC1.BSA (1 μg); PC2.BSA (2 μg); pET.The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;1.The cell lysates of pThCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2.The cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;pET1.The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET2.The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;3.The supernatant of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4.The precipitation of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 5.The supernatant of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6.The precipitation of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃圖2 rTFNCPAm4的原核表達與鑒定Fig 2 Prokaryotic expression and identification of rTFNCPAm4

M:蛋白Marker; 1:包涵體溶解離心后上清；2:上清與Ni-IDA孵育后流出液；3-4:50 mmol/L Imidazole的洗脫液；5-9:300 mmol/L Imidazole的洗脫液M:protein Marker; 1:The supernatant of dissolved inclusion bodies; 2:The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;3-4:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer(contain 50 mmol/L Imidazole ); 5-9:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 300 mmol/L Imidazole)圖3 rTFNCPAm4的純化Fig 3 Purification of rTFNCPAm4

M. 蛋白Marker；1. pET 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；2. 純化后的rTFNCPAm4M: Protein Marker; 1: The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 2: rTFNCPAm4 after purification圖4 與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清反應(yīng)的Western blot鑒定Fig 4 The identification of rTFNCPAm4 with antitoxin serum of Clostridium perfringens type A by Western blot

1. 10倍濃縮的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；2. A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；3.肉肝胃酶消化湯；4. 純化后的rTFNCPAm41. Clostridium perfringens type A toxin 10-fold concentrated; 2. Clostridium perfringens type A toxin;3. anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup; 4. rTFNCPAm4 after purification圖5 重組蛋白的卵磷脂酶活性鑒定Fig 5 The identification of phosphlipase C of rTFNCPAm4

1-6. 101～106倍稀釋的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；7.肉肝胃酶消化湯；8. 純化后的rTFNCPAm4；9. 蛋白溶解液；10. dd H2O1-6. Clostridium perfringens type A toxin with dilution of 101～106; 7. anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup;8. rTFNCPAm4 after purification; 9. elution buffer; 10. dd H2O圖6 重組蛋白的溶血活性鑒定Fig 6 The identification of lysing red blood cells activity of rTFNCPAm4

表1 樣品的注射以及小鼠存活情況Tab 1 Injection of sample and the mouse survival

2.5 rTFNCPAm4的免疫原性分析

2.5.1 抗rTFNCPAm4兔血清的中和抗體效價測定

經(jīng)血清中和法測定，以rTFNCPAm4免疫兔子后，1毫升的一免抗血清可中和10個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；1毫升的二免抗血清可中和40個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素?zé)o中和作用。

2.5.2 攻毒保護性試驗 在二免21 d后，對所有rTFNCPAm4免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1個MLD劑量的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，結(jié)果佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡(4/4)，rTFNCPAm4免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應(yīng)。

3 討 論

基因工程亞單位疫苗研制的關(guān)鍵是免疫原的研究與篩選。與產(chǎn)氣莢膜梭菌的其他3種主要致死性外毒素(CPB、ETX 及CPI)不同，天然的CPA經(jīng)過通過甲醛滅活后，其抗原性會明顯降低[18-19]，而未經(jīng)突變的重組CPA仍存在一定的毒力，不適合直接用于疫苗制備[20]。為此，實現(xiàn)CPA的減毒乃至無毒，成為眾多學(xué)者的研究方向。CPA分子主要由N末端(1-246)和C末端(247-370)構(gòu)成。其中，具有細胞毒性的N末端是CPA的酶活性中心，而無細胞毒性的C末端主要發(fā)揮著與細胞受體相結(jié)合的功能[10]。雖然單獨的C末端具有一定的免疫保護作用，但由于分子量較小，該部分需要與GST標簽蛋白[21-22]或其他毒素蛋白[23-24]融合表達，從而造成實際抗原量降低，且難以對C末端的免疫保護性進行準確定量。此外，針對CPA第193-198位氨基酸片段的單抗在體外和體內(nèi)實驗中均被證實有很好的免疫保護作用[25]，這說明完整的CPA分子能夠更加充分地發(fā)揮免疫保護作用。據(jù)報道，通過對CPA關(guān)鍵氨基酸位點進行點突變能夠?qū)崿F(xiàn)對CPA的減毒乃至無毒[11,26-27]。然而，此類研究僅僅進行了單氨基酸位點的突變，且沒有對突變后的CPA進行抗原性分析。為此，選擇該毒素N末端酶活性中心的Zn2+結(jié)合位點[11](第56位和第130位氨基酸)以及C末端與Ca2+結(jié)合的主要位點(第275和第336位氨基酸)同時進行突變，從而降低了因單個氨基酸突變在未來基因工程疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中可能造成的生物安全隱患。

結(jié)果表明，在15 ℃和37 ℃條件下誘導(dǎo)，經(jīng)灰度掃描測定，rTFNCPAm4可溶性表達比例均低于1%，且表達量無明顯差異。綜合考慮蛋白表達量和誘導(dǎo)時間，實驗最終選擇37 ℃進行誘導(dǎo)。實驗結(jié)果證明，以非可溶形式表達的rTFNCPAm4經(jīng)純化復(fù)性后具有較好的免疫原性。此外，與可溶性表達的蛋白純化過程相比，對以非可溶形式表達的重組蛋白進行純化，可顯著降低純化產(chǎn)物中內(nèi)毒素的含量，更適用于大規(guī)模獸用疫苗的制備。進一步的實驗表明，rTFNCPAm4在檢測范圍內(nèi)無卵磷脂酶和溶血酶活性且5.5 mg/kg劑量的rTFNCPAm4對小鼠仍無致死性，說明rTFNCPAm4已成功減毒。更重要的是，rTFNCPAm4具有良好的免疫原性，是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌及其它梭菌類毒素聯(lián)苗的基因工程亞單位疫苗的重要候選抗原。然而，在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)可溶性重組ETX免疫原性明顯高于非可溶性的重組蛋白。因此，如何提高rTFNCPAm4的可溶性表達水平，將是后續(xù)研究的重點。