盧克歡 劉 興 楊 怡 廖志華 吳能表,*

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UV-B脅迫下Ca2+對(duì)顛茄生理特性與次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控研究

盧克歡1劉 興1楊 怡1廖志華2吳能表1,*

1西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715;2西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715

有害中波紫外線(Ultraviolet B, UV-B; 280~320 nm)輻射影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育, Ca2+是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的大量元素之一, 外源Ca2+不但可以提高植物抗脅迫能力, 還對(duì)次生代謝具有調(diào)控作用。以顛茄(L.)實(shí)生苗為材料, 在UV-B輻射(10 μW cm–2)背景下, 研究不同濃度外源Ca2+、不同處理時(shí)間對(duì)顛茄生理特性、氮代謝、次生代謝產(chǎn)物含量以及托品烷類生物堿代謝途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明, 隨著UV-B輻射時(shí)間的延長(zhǎng)(4 ~12 d), 對(duì)顛茄的光合作用、氮代謝以及生物堿的積累產(chǎn)生抑制作用, 加劇了膜脂氧化程度; 經(jīng)外源Ca2+處理, 葉片初始熒光(o)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量呈下降趨勢(shì), 葉片最大光化學(xué)效率(vm)、光合色素(總?cè)~綠素、類胡蘿卜素)含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均呈上升趨勢(shì), 說(shuō)明Ca2+有利于緩解UV-B輻射的抑制, 加強(qiáng)對(duì)UV-B脅迫的抗性; 在Ca2+處理下, 葉片中硝態(tài)氮含量顯著降低, 游離氨基酸、可溶性蛋白含量和氮代謝關(guān)鍵酶(NR、GS、GDH)的活性顯著提高, 葉片中莨菪堿含量和東莨菪堿含量顯著提高; qRT-PCR分析顯示, 在外源Ca2+的誘導(dǎo)下, 托品烷類生物堿合成途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶基因(、、)表達(dá)量均有不同程度上調(diào)趨勢(shì)。本研究結(jié)果可為田間種植提供理論參考。

UV-B脅迫; 顛茄; 生理特性; 氮代謝; 托品烷類生物堿

顛茄(L.), 茄科顛茄屬, 多年生草本植物, 全草可入藥, 是我國(guó)藥典規(guī)定的托品烷類生物堿(tropane alkaloids, TAs)藥源植物[1]。TAs包括莨菪堿和東莨菪堿, 是一類重要的抗膽堿藥物, 提取自茄科植物的次生代謝產(chǎn)物, 具有多方面的藥用價(jià)值, 廣泛用于麻醉、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、抗暈動(dòng)病, 也可用于控制帕金森病的僵直和震顫[2-3]。顛茄中的TAs含量極低, 有著較高的藥用價(jià)值, 且市場(chǎng)需求量巨大。顛茄作為托品烷類生物堿的重要藥源植物, 如何提高其次生代謝產(chǎn)物莨菪堿和東莨菪堿的合成具有十分重要的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。

地球的大氣臭氧層是抵抗紫外輻射的保護(hù)層, 它能夠有效吸收強(qiáng)烈的太陽(yáng)光帶來(lái)的紫外線輻射, 保護(hù)地球上的生物免受傷害。隨著工業(yè)化發(fā)展的進(jìn)程, 氟氯烷烴和氮氧化物的大量排放, 導(dǎo)致地球臭氧層變薄甚至出現(xiàn)空洞, 到達(dá)地表的有害中波紫外線逐漸增強(qiáng), 對(duì)植物的生長(zhǎng)極為不利[4-5]。UV-B不僅作為一種環(huán)境脅迫導(dǎo)致植物DNA損傷、細(xì)胞分裂停滯、細(xì)胞死亡以及生長(zhǎng)受抑制, 也能夠調(diào)控植物形態(tài)建成與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng), 同時(shí)影響包括類黃酮、單寧等多種次生代謝物合成。

鈣是植物體內(nèi)不可或缺的礦物質(zhì)元素, 同時(shí)也是維持植物細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝的重要離子, 作為偶聯(lián)細(xì)胞外信號(hào)的第二信使, 在維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜結(jié)合蛋白穩(wěn)定性、調(diào)控多種酶活性方面都具有重要作用[6-7]。Ca2+和鈣調(diào)素參與脅迫信號(hào)的感受、傳遞、響應(yīng)與表達(dá)等過(guò)程, 以增強(qiáng)植物抗逆性[8]。Ca2+在逆境條件下可以保持植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[9], 激活或抑制細(xì)胞內(nèi)特定酶的活性, 調(diào)節(jié)逆境中植物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)[10-11]。外施Ca2+可以增強(qiáng)鹽脅迫下唐古特白刺氮代謝中關(guān)鍵酶的活性,促進(jìn)對(duì)無(wú)機(jī)氮源的吸收, 保護(hù)氮代謝途徑不受鹽脅迫的破壞[12]; 在干旱脅迫下, Ca2+可以促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng), 提高葉片的葉綠素的含量、凈光合速率、蒸騰速率以及水分利用率, 降低膜脂過(guò)氧化程度及脯氨酸和可溶性蛋白的積累量, 緩解干旱對(duì)黃瓜幼苗的不利影響, 從而增強(qiáng)植株對(duì)干旱脅迫的抗性[13]; 適宜濃度的外源Ca2+能明顯改善低溫脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的抑制作用, 提高玉米幼苗在低溫脅迫下的適應(yīng)能力[14]。此外, 外源Ca2+對(duì)植物的次生代謝也起著顯著作用, 外源Ca2+可以影響水蓼細(xì)胞中黃烷醇[15]、曼陀羅細(xì)胞中莨菪堿[16]、田七細(xì)胞中人參皂苷Rb1[17]和咖啡細(xì)胞中生物堿[18]等次生代謝物的生物合成與積累。Ca2+對(duì)于提高植物逆境適應(yīng)性及次生代謝調(diào)控具有重要的生理作用, 其是否參與調(diào)控顛茄在UV-B脅迫條件下的逆境適應(yīng)性和次生代謝產(chǎn)物的合成還有待探究。本試驗(yàn)旨在探究UV-B脅迫條件下, 外源Ca2+對(duì)顛茄光合及耐逆生理特性、次生代謝產(chǎn)物積累方面的功能, 對(duì)于提高顛茄次生代謝產(chǎn)物托品烷類生物堿的合成具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

顛茄(L.)種子購(gòu)自湖南芝茵農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司, 并經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳能表教授鑒定。

挑選顆粒飽滿的顛茄種子, 充分浸潤(rùn)后置濕潤(rùn)濾紙上, 待萌發(fā)后移栽至盛有混勻介質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石= 3∶1∶1)的營(yíng)養(yǎng)盆(12 cm×13 cm)中, 每盆3株, 共300盆, 于25°C溫室內(nèi)培養(yǎng), 每7 d澆灌一次稀釋10倍的MS營(yíng)養(yǎng)液, 2個(gè)月后, 挑選200盆長(zhǎng)勢(shì)一致的顛茄幼苗, 開始試驗(yàn)處理。以顛茄葉片中MDA含量和抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的變化為參考標(biāo)準(zhǔn), 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定UV-B脅迫所用的輻照強(qiáng)度為10 μW cm–2, 參照楊衛(wèi)星等[19]研究中的處理濃度并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取5個(gè)CaCl2溶液梯度濃度, 每天12:00—12:40進(jìn)行相同強(qiáng)度的UV-B照射, 同時(shí)以CaCl2噴施葉片至溶液欲滴, 處理方式見表1。

分別在第4、第8和第12天采集顛茄葉片, 存放于-80°C冰箱, 用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。另采集顛茄根、葉組織材料, 一部分凍存于液氮中, 用于基因表達(dá)量的測(cè)定; 另一部分于70°C烘箱中烘干, 用于生物堿含量的測(cè)定。設(shè)置每處理組3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)o和vm的測(cè)定

將顛茄植株暗處理2 h, 選擇長(zhǎng)勢(shì)一致且較為平展的葉片(避開主葉脈)用葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2100 (WALZ, 德國(guó))測(cè)定初始熒光(o)和最大光化學(xué)效率(vm), 取3次數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.2 光合色素與MDA含量的測(cè)定 參照張憲政[20]的方法, 稱取0.2 g新鮮的顛茄葉片, 去中脈, 剪成細(xì)絲狀, 置黑暗條件下浸泡于20 mL丙酮-乙醇混合液(1∶1) 72 h至白色。取上清液3 mL于石英比色皿中, 測(cè)吸光值663、645和470, 計(jì)算葉綠素含量和類胡蘿卜素含量。參照Velikova等[21]的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測(cè)定MDA含量。

表1 顛茄幼苗的處理組合

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 參照Giannopolitis和Ries[22]的方法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 通過(guò)觀察NBT的光還原抑制程度, 將能夠抑制反應(yīng)酶量的50%定義為1個(gè)SOD活力單位(U); 采用愈創(chuàng)木酚法[23]測(cè)定過(guò)氧化物酶(peroxide, POD)活性, 將每分鐘470值升高0.01定義為1個(gè)酶活力單位(U); 參照高俊鳳[24]的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性, 將每分鐘240下降0.1定為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 硝態(tài)氮、游離氨基酸和可溶性蛋白含量的測(cè)定 參照高俊鳳[24]的方法測(cè)定硝態(tài)氮含量。NO3–與水楊酸生成硝基水楊酸, 在堿性條件下(pH > 12)呈黃色, 檢測(cè)410值反映硝態(tài)氮的含量; 參照李合生[25]的茚三酮溶液顯色法測(cè)定游離氨基酸含量; 參照高俊鳳[24]的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.2.5 GS、NR和GDH活性的測(cè)定 采用湯紹虎等[26]的方法測(cè)定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性。在ATP和Mg2+存在下, GS催化植物體內(nèi)谷氨酸形成谷氨酰胺, 谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為γ-谷氨?；惲u肟酸, 進(jìn)而在酸性條件下與鐵形成紅色絡(luò)合物, 在540 nm處有最大吸收峰, 即以γ-谷氨酰基異羥肟酸與鐵絡(luò)合物的生成量來(lái)表示GS酶活性; 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒分別測(cè)定硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)活性與谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenation enzyme, GDH)活性。

1.2.6 莨菪堿與東莨菪堿的提取與測(cè)定 參照Z(yǔ)árate等[27]的方法, 略有改動(dòng), 提取顛茄葉片中莨菪堿和東莨菪堿; 用HPLC測(cè)定其含量, 色譜儀為日本島津(Shimadzu) LC-60A高效液相色譜儀(泵: LC-20AD, 控制器: SPD-20A, 柱溫箱: CTO-10AS vp); 色譜柱為Ultimate XB-C18液相色譜柱(5 μm, 4.6 mm×250.0 mm); 流動(dòng)相為甲醇∶醋酸緩沖液(20 mmol L–1醋酸銨, 0.1%甲酸, pH 4.0) = 1∶4; 檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm; 流速1.0 mL min–1; 柱溫40°C; 進(jìn)樣量10 μL。

1.2.7 總RNA的提取及cDNA的合成 按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒使用說(shuō)明提取總RNA。按照TIANGENFastQuant RT Kit (with gDNase)說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行顛茄根、葉RNA的反轉(zhuǎn)錄, gDNA去除反應(yīng)體系10 μL, 分別為5×gDNA buffer 2 μL, 17.5 ng μL–1Total RNA 8 μL, 反應(yīng)條件為42°C孵育3 min, 冰浴暫存; 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL, 分別為10×Fast RT buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL; 將10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加入到去基因組DNA污染的Total RNA, 反應(yīng)條件為42°C 15 min, 95°C 3 min, 冰浴5 min, 獲得cDNA。

1.2.8 引物設(shè)計(jì)與qRT-PCR、、和基因引物根據(jù)NCBI上公布的序列設(shè)計(jì)及參照強(qiáng)瑋等[28-29]的引物序列, 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表2)。采用Promega GoqPCR Master Mix試劑盒使用說(shuō)明檢測(cè), 反應(yīng)體系20 μL, 分別為GoqPCR Master Mix 10.0 μL、各基因上游引物 (10 μmol L–1) 0.4 μL、各基因下游引物(10 μmol L–1) 0.4 μL、cDNA模板2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為Stage 1 預(yù)變性, 95°C 10 min; Stage 2擴(kuò)增循環(huán), 95°C 15 s, 60°C 1 min, 共40循環(huán); Stage 3溶解曲線, 95°C 5 s, 60°C 15 s, 95°C 15 s。依制造商的操作說(shuō)明在Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad, USA)上完成, 以為內(nèi)參基因, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Pfaffl Method法計(jì)算得出結(jié)果。

表2 熒光定量PCR所需引物

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄葉片F(xiàn)o和Fv/Fm的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以較為靈敏地反映光合作用的變化情況, 被稱為研究植物光合功能的快速、無(wú)損傷探針[30]。初始熒光o表示PS II反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量。在UV-B脅迫下, 在各處理時(shí)間段內(nèi), T1組比T0組的o顯著升高, 并隨著處理時(shí)間的增加逐漸增大; 噴施不同濃度Ca2+處理后, 不同處理組較T1有不同程度的回落現(xiàn)象, 且當(dāng)處理時(shí)間為12 d、濃度為6 mmol L–1時(shí)緩解效果最為顯著(圖1-A)。

v/m代表PS II的最大光化學(xué)效率, 是較為常用的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)之一, 此指標(biāo)在脅迫條件下通常會(huì)降低[31], 同時(shí)也可以表明PS II遭受到破壞[32]。在UV-B脅迫下, T1處理組的v/m相對(duì)T0組顯著降低, 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), T1處理組的vm呈下降趨勢(shì), 經(jīng)不同濃度Ca2+處理后, 在各時(shí)間段均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢(shì), 在處理第12天中, 當(dāng)Ca2+濃度為4 mmol L–1時(shí), 與T1相比大幅提高, 緩解效果最顯著(圖1-B)。

圖1 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄初始熒光(A)和最大光化學(xué)效率(B)的影響

不同小寫字母表示相同處理時(shí)間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(<0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1、6 mmol L–1和8 mmol L–1。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.2 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄葉片中光合色素含量的影響

在植物葉片中, 葉綠素含量與類胡蘿卜素含量是表征植物體光合能力的重要指標(biāo)。由圖2可知, T1組隨著UV-B處理時(shí)間的延長(zhǎng), 顛茄葉片中的葉綠素含量與類胡蘿卜素含量逐漸降低; 在各處理時(shí)間段內(nèi), T1組的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量比T0對(duì)照組顯著降低, 經(jīng)過(guò)噴施不同濃度Ca2+溶液處理后, 二者均有不同程度的上升趨勢(shì)。當(dāng)Ca2+溶液濃度為6 mmol L–1時(shí)效果最顯著, 如在處理12 d時(shí), T4組相比T1組, 總?cè)~綠素含量與類胡蘿卜素含量分別提高了64.8%和56.1%。說(shuō)明適宜濃度的外源Ca2+有助于促進(jìn)葉綠素和類胡蘿卜素的合成, 有效緩解UV-B輻射對(duì)光合膜的破壞, 從而有利于顛茄在UV-B迫下增強(qiáng)其光合能力。

圖2 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄葉片中總?cè)~綠素含量(A)與類胡蘿卜素含量(B)的影響

不同小寫字母表示相同處理時(shí)間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄抗氧化酶活性和MDA含量的影響

植物體中抗氧化酶活性的變化在一定程度上可反映出植物體抗逆性的強(qiáng)弱[33]。對(duì)于T1處理組, SOD和POD活性的變化基本一致, 均隨UV-B處理時(shí)間的增加呈先升后降趨勢(shì)(圖3-A, B)。CAT的活性在T1處理下, 隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降(圖3-C)。UV-B處理的第8天和第12天, T1組中SOD、POD和CAT三種酶的活性比T0對(duì)照組均顯著降低, 說(shuō)明UV-B輻射對(duì)顛茄的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了脅迫效應(yīng), 且隨著處理時(shí)間的增加其脅迫效應(yīng)愈加嚴(yán)重。在不同濃度Ca2+處理下, 3種抗氧化酶的活性均有不同程度提高, 在各處理時(shí)間范圍內(nèi), 當(dāng)Ca2+濃度為4 mmol L–1和6 mmol L–1時(shí)緩解效果較為顯著。

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物, 可以作為衡量植物膜脂過(guò)氧化的程度。在UV-B輻射處理下, MDA含量比T0對(duì)照組大幅升高, 且隨著UV-B處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)。在UV-B輻射背景下, 經(jīng)不同濃度外源Ca2+處理后發(fā)現(xiàn), 在3個(gè)不同的處理時(shí)間段內(nèi), MDA含量均顯著降低。表明外源Ca2+可緩解UV-B輻射對(duì)顛茄膜系統(tǒng)的損害程度。其中, 在處理12 d, T4組MDA含量比T1組降低了52.2%, 緩解效果最顯著(圖3-D)。

2.4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄氮代謝的影響

硝態(tài)氮是能夠被植物根部直接吸收的氮源, 植物吸收的無(wú)機(jī)氮源經(jīng)一系列的還原與同化作用后形成游離氨基酸、可溶性蛋白等有機(jī)含氮化合物[34], 它們的含量是氮代謝的重要指標(biāo), 直接反映氮代謝的基本進(jìn)程。由表3可知, 隨著UV-B處理時(shí)間的延長(zhǎng), T1處理組硝態(tài)氮含量逐漸增加, 經(jīng)噴施Ca2+溶液后, 各處理組的硝態(tài)氮含量隨著處理時(shí)間的增加呈先降低后升高的趨勢(shì), 同時(shí)在相同處理時(shí)間下, 其含量也隨著Ca2+濃度的升高而降低。在UV-B輻射下, T1組游離氨基酸含量和可溶性蛋白含量比T0組顯著降低, 且隨著UV-B處理時(shí)間的延長(zhǎng), 游離氨基酸含量逐漸降低, 可溶性蛋白含量在處理第4天有所升高, 隨后開始持續(xù)降低, 經(jīng)不同濃度Ca2+處理后, 對(duì)于相同的處理時(shí)間, 兩者含量相對(duì)T1組升高顯著。表明UV-B輻射有利于顛茄葉片中硝態(tài)氮的積累, 但不利于對(duì)硝態(tài)氮的利用, 從而使游離氨基酸和可溶性蛋白等含氮化合物含量降低, 不利于氮代謝的進(jìn)行。在Ca2+處理下, 加速了硝態(tài)氮的同化, 使游離氨基酸和可溶性蛋白含量顯著升高, 表明外源Ca2+可以有效緩解UV-B脅迫對(duì)氮代謝進(jìn)程的抑制, 有利于氮代謝的進(jìn)行。

在氮代謝途徑中, 硝酸還原酶(NR)是催化硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為NH4+-N的酶, 而NH4+-N與α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶(GDH)的催化下進(jìn)一步形成Glu; 同時(shí), 谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代謝過(guò)程中的另一個(gè)關(guān)鍵酶, 能催化NH4+-N和Glu合成谷氨酰胺, 對(duì)于高等植物同化NH4+-N具有重要的作用[35]。由表4可知, UV-B輻射處理使葉片中NR、GS和GDH酶活性顯著降低。T1處理組中, 在UV-B脅迫下NR和GS活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低, 而GDH則是先增大后減小的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)不同濃度的Ca2+處理后, 相同處理時(shí)間內(nèi), 3個(gè)關(guān)鍵酶的活性均有不同程度的升高趨勢(shì)。對(duì)于NR和GS, 當(dāng)Ca2+濃度為6 mmol L–1時(shí)效果最顯著, 對(duì)于GDH則是4 mmol L–1效果最佳。以上結(jié)果表明, 短期UV-B輻射可以激活GDH活性的增大, 但是總體來(lái)看, UV-B輻射抑制了NR、GS和GDH的活性, 不利于顛茄氮代謝的進(jìn)行。在適宜濃度外源Ca2+處理下, 可顯著提高3種關(guān)鍵酶的活性, 緩解UV-B脅迫對(duì)顛茄氮代謝關(guān)鍵酶活性的抑制作用, 從而加速顛茄對(duì)無(wú)機(jī)氮源的同化作用。

圖3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄抗氧化酶活性(A, B, C)、丙二醛含量(D)的影響

不同小寫字母表示相同處理時(shí)間不同濃度Ca2+處理間差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca2+concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

表3 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄硝態(tài)氮、游離氨基酸和可溶性蛋白含量的影響

(續(xù)表3)

表中同一列數(shù)據(jù)上標(biāo)以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2 , 4 , 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

表4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活性的影響

表中同一列數(shù)據(jù)上標(biāo)以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.5 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄葉片中托品烷類生物堿含量的影響

莨菪堿和東莨菪堿是托品烷類生物堿最主要的兩種生物堿, 也是藥用價(jià)值最高的兩種成分。由表5可知, 在UV-B輻射處理第8天和第12天時(shí), 顛茄葉片中莨菪堿和東莨菪堿含量相比T0對(duì)照組均顯著降低, T1處理組中, 隨著UV-B處理時(shí)間的增加, 莨菪堿的含量先升高后降低, 東莨菪堿含量則是持續(xù)降低, 表明短期UV-B輻射可以促進(jìn)莨菪堿的積累,但中長(zhǎng)期輻射不利于托品烷類生物堿的積累。外施不同濃度Ca2+處理后, 在相同處理時(shí)間下, 莨菪堿與東莨菪堿的含量均比T1組有所提高, 隨著Ca2+濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)。處理12 d時(shí), T4組的莨菪堿與東莨菪堿含量較T1組顯著提高, 分別提高了15.7%和31.9%。以上結(jié)果表明, 短期UV-B輻射可以促進(jìn)莨菪堿的積累, 中長(zhǎng)期輻射不利于托品烷類生物堿的積累, 總體而言, UV-B輻射不利于顛茄對(duì)莨菪堿與東莨菪堿的積累, 而適宜濃度的外源Ca2+可以有效緩解UV-B輻射對(duì)TAs積累的抑制。

表5 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄葉片莨菪堿和東莨菪堿含量的影響

表中同一列數(shù)據(jù)上標(biāo)以不同小寫字母表示差異顯著(< 0.05)。T1至T5分別代表UV-B脅迫下不同濃度Ca2+處理組, 分別為0、2、4、6和8 mmol L–1。T0表示未進(jìn)行任何處理, 即空白對(duì)照組。

Figures followed by different letters in each column are significantly different (< 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca2+concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L–1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.6 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄根、葉中PMT、TR I、H6H相對(duì)表達(dá)量的影響

腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(putrescine N-methyltransferase, PMT)、托品酮還原酶Ι (tropinone reductase Ι, TR Ι)、莨菪堿-6-β-羥化酶(hyoscyamine-6-β-hydroxylase, H6H)是托品烷類生物堿合成途徑中的3個(gè)關(guān)鍵酶, 其相應(yīng)編碼基因的表達(dá)量直接決定合成途徑的中間產(chǎn)物流向以及生物堿的產(chǎn)量[36]。以為內(nèi)參基因, 采用qRT-PCR檢測(cè)了UV-B脅迫下處理12 d中T0組、T1組和T4組的顛茄根、葉中、和基因相對(duì)表達(dá)量。和在根中表達(dá)量較高,的表達(dá)量相對(duì)較低, 由T1組和T0組相比可知, 在UV-B處理12 d后,和的表達(dá)量均顯著降低, 而則有所升高, 但不顯著; 由T4組和T1組對(duì)比可知, 同樣在UV-B處理下, 經(jīng)6 mmol L–1外源Ca2+處理后, 顯著促進(jìn)了、和的表達(dá)(圖4-A)。在葉中幾乎不表達(dá), 而明顯表達(dá), 且表達(dá)水平較高; 在UV-B處理12 d后,的表達(dá)量較T0組有所升高但不顯著, 經(jīng)6 mmol L–1外源Ca2+處理后, 顯著促進(jìn)了的表達(dá)(圖4-B)。

圖4 UV-B脅迫下不同濃度Ca2+對(duì)顛茄根(A)、葉(B)中PMT、H6H、TR I相對(duì)基因表達(dá)量的影響

標(biāo)以不同小寫字母的柱值在同一個(gè)基因不同處理組間差異顯著(< 0.05)。T0組表示未進(jìn)行任何處理的空白對(duì)照, T1組表示UV-B輻射處理12 d, T4組表示UV-B輻射背景下外施6 mmol L–1Ca2+處理12 d。

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments in the same gene at the 0.05 probability level. T0 group indicates untreated blank control groups; T1 group indicates UV-B radiation treatment for 12 days; T4 group indicates exogenous 6 mmol L–1Ca2+treatment for 12 days under UV-B stress.

3 討論

光合作用的強(qiáng)弱對(duì)植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及抗逆性都具有十分重要的影響[37], 植物光合作用受到傷害的最初部位是與PS II緊密聯(lián)系的, 而逆境脅迫往往會(huì)導(dǎo)致葉綠體光合機(jī)構(gòu)的破壞, 降低PS II原初光能轉(zhuǎn)換效率、抑制PS II潛在活性, 導(dǎo)致PS II功能下降[38]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, UV-B輻射下, 相比T0對(duì)照組,o顯著升高,vm顯著降低, 且隨著UV-B輻射時(shí)間的延長(zhǎng), 初始熒光o逐漸增大, 最大光化學(xué)效率vm逐漸減小, 而在適宜濃度外源Ca2+處理下, 相比T1組,o顯著降低,vm明顯增大。表明顛茄在UV-B輻射條件下, 葉片中PS II反應(yīng)中心受到傷害, 導(dǎo)致其原初能量轉(zhuǎn)換發(fā)生紊亂, 其葉綠素分子在吸收光能后, 激發(fā)態(tài)分子多以發(fā)出熒光的形式釋放能量, 而參與到光合作用的能量有所減少, 不利于光合作用的進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上, Ca2+可以有效地抵御UV-B對(duì)PS II反應(yīng)中心的傷害, 緩解了葉片產(chǎn)生的光抑制, 可提高PS II的光能轉(zhuǎn)換效率, 使顛茄在UV-B脅迫下依然保持較高的光化學(xué)效率。這與秦舒浩等[39]提出的外源Ca2+有利于緩解高溫強(qiáng)光對(duì)西葫蘆幼苗葉片的光抑制和溫光破壞現(xiàn)象, 有效保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)相一致。對(duì)光合作用而言, 葉綠素與類胡蘿卜素是參與光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的重要色素, 因此葉綠素含量會(huì)直接影響植物的生長(zhǎng)。葉綠素含量的高低直接影響著光合速率和光合產(chǎn)物的形成, 類胡蘿卜素除吸收傳遞光能外, 還可起保護(hù)作用[40]。試驗(yàn)結(jié)果顯示, UV-B脅迫下, 顛茄葉片中總?cè)~綠素與類胡蘿卜素含量都顯著下降, 經(jīng)不同濃度Ca2+處理下其含量有所上升。表明UV-B輻射加速了葉綠素和類胡蘿卜素的分解, 不利于顛茄進(jìn)行正常的光合作用。而適當(dāng)濃度的外源Ca2+有助于緩解UV-B輻射對(duì)葉綠體膜的破壞, 維持較高的光合色素含量, 保護(hù)葉綠體膜結(jié)構(gòu)的完整性。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)是植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的主要成員, 是防御活性氧及其他自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害的最重要的酶[41]。MDA是膜脂過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物之一, 其量的高低是膜脂過(guò)氧化強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)[42]。本試驗(yàn)中, SOD和POD活性在UV-B脅迫下先升高后降低, CAT活性則是持續(xù)降低, 表明顛茄在UV-B照射初期可以通過(guò)自身調(diào)節(jié)SOD和POD活性的升高抵御逆境脅迫, 但隨著UV-B照射時(shí)間的推移, SOD、POD和CAT的活性均有所降低, 表明長(zhǎng)時(shí)間UV-B輻射加劇了顛茄細(xì)胞的氧化程度, 不利于正常的生理活動(dòng)。在外源Ca2+處理下, 相比同期處理下的T1組, 3種抗氧化酶的活性呈現(xiàn)出顯著升高趨勢(shì)。同時(shí), 在UV-B脅迫下, 相比T0對(duì)照組, 膜脂過(guò)氧化主要產(chǎn)物MDA含量大幅上升, Ca2+處理后相比同期處理的T1組顯著降低, 且當(dāng)Ca2+濃度為6 mmol L–1時(shí)最為顯著。以上結(jié)果表明, UV-B輻射會(huì)導(dǎo)致顛茄細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度增強(qiáng), 膜透性增加, 加劇了氧化損傷; SOD、POD和CAT活性的顯著降低, 打破了在其共同作用下維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝平衡, 無(wú)法及時(shí)清除體內(nèi)的超氧自由基和H2O2等有害物質(zhì)。而外源Ca2+則有助于刺激顛茄細(xì)胞產(chǎn)生更多的抗氧化酶或者提高抗氧化酶的活性, 從而降低活性氧水平, 抑制膜脂過(guò)氧化, 有利于提高顛茄在逆境條件下的抗性。這與邢建永等[43]提出的Ca2+能夠提高半夏類原球莖的抗氧化性, 提高其抗逆性的觀點(diǎn)相一致。

植物的次生代謝是以初生代謝為基礎(chǔ), 初生代謝中氮代謝尤為重要。硝態(tài)氮是可被植物根系直接吸收的無(wú)機(jī)氮源, 經(jīng)氮代謝途徑中相關(guān)酶的催化作用合成植物自身需要的含氮有機(jī)物, 如氨基酸和蛋白質(zhì)等。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 在UV-B脅迫下, 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), 顛茄葉片組織內(nèi)的硝態(tài)氮含量逐漸增加, 游離氨基酸與可溶性蛋白含量逐漸降低。在外源Ca2+處理下, 游離氨基酸和可溶性蛋白含量顯著提高, 有效緩解了UV-B輻射對(duì)含氮有機(jī)物合成的抑制, 適宜濃度的Ca2+有助于提高UV-B脅迫下氮代謝關(guān)鍵酶的活性, 加速顛茄對(duì)硝態(tài)氮的同化, 從而提高自身含氮有機(jī)物的積累, 尤其是促進(jìn)氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化。這與高彥博[12]提出的外源Ca2+可以有效提高唐古特白刺氮代謝中關(guān)鍵酶的活性促進(jìn)對(duì)硝態(tài)氮的利用的觀點(diǎn)相一致。同時(shí), 通過(guò)促進(jìn)氮代謝的進(jìn)程, 有利于鳥氨酸和精氨酸的合成, 從而有利于生物堿的前體物質(zhì)腐胺的積累。

莨菪堿和東莨菪堿是顛茄次生代謝的產(chǎn)物, 主要在根中合成, 存貯積累在地上部分的幼嫩組織中[28]。鈣鹽對(duì)半夏類原球莖總生物堿的合成具有顯著影響,適宜濃度的Ca2+提高半夏類原球莖有用次生代謝產(chǎn)物的量[19,43]。UV-B輻射可以誘導(dǎo)生物堿含量的增加, 溫泉等[44]研究發(fā)現(xiàn)隨著UV-B輻射時(shí)間的增加, 黃連中小檗堿含量逐漸增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 在UV-B輻射處理下, 隨著輻射時(shí)間的增加, 顛茄葉片中東莨菪堿含量逐漸降低, 莨菪堿含量則是先增后降, 不利于總生物堿的積累。隨著Ca2+濃度的增加, 相同處理時(shí)間下莨菪堿與東莨菪堿的含量先增后降,當(dāng)Ca2+濃度為4 mmol L–1和6 mmol L–1時(shí)效果較為顯著。以為內(nèi)參基因, 經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),和在根中均有表達(dá), 在葉片中只有表達(dá),和幾乎不表達(dá)。這與強(qiáng)瑋等[28-29]提出的、、均只在顛茄根中大量表達(dá),在成熟葉片中強(qiáng)烈表達(dá), 其次在花苞和根中少量表達(dá)的觀點(diǎn)相似。除此之外, 結(jié)果顯示, UV-B輻射抑制了和的表達(dá)水平, 卻可以促進(jìn)的表達(dá), 但不顯著; 而外源Ca2+可以有效激活和的表達(dá), 有助于緩解UV-B輻射對(duì)和表達(dá)的抑制作用。表明Ca2+通過(guò)激活的高效表達(dá), 促進(jìn)腐胺從多胺代謝轉(zhuǎn)向TAs合成,的高表達(dá)有利于托品酮生成托品的支流方向, 進(jìn)而提高莨菪堿和東莨菪堿的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

UV-B輻射不利于顛茄的正常生長(zhǎng)與次生代謝物的積累, 外源Ca2+可有效緩解UV-B輻射對(duì)顛茄的脅迫效應(yīng), 有利于顛茄光合作用, 促進(jìn)無(wú)機(jī)氮源的同化, 加速無(wú)機(jī)氮源轉(zhuǎn)化為自身所需的含氮化合物, 進(jìn)而有利于顛茄次生代謝途徑中前體物質(zhì)合成。雖然UV-B輻射可促進(jìn)基因的表達(dá), 但不利于和基因的正常表達(dá), 降低了莨菪堿和東莨菪堿的合成效率, 而適宜濃度的外源Ca2+可有效解除UV-B對(duì)顛茄次生代謝的抑制效應(yīng)。

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Effect of Exogenous Ca2+on Physiological Characteristics and Secondary Metabolites accumulation ofL. Seedlings under UV-B Stress

LU Ke-Huan1, LIU Xing1, YANG Yi1, LIAO Zhi-Hua2,and WU Neng-Biao1,*

1Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education / School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

Ultraviolet B (UV-B) radiation does harm to plant, for which growth and development. Ca2+is one of the most necessary elements. Exogenous Ca2+can enhance plant abilities to resist stress and regulate secondary metabolism. In this research, we usedL. seedlings to investigate the effects of different concentrations of exogenous Ca2+and different treatment days on the physiological characteristics, nitrogen metabolism, secondary metabolites content and relative genes expression levels of three key enzymes in secondary metabolism under the background of UV-B radiation. The UV-B radiation not only caused inhibitory effect on theL. photosynthesis, nitrogen metabolism, alkaloid content, but also increased peroxidation of membrane lipid. Theo, MDA content gradually decreased, but thevm, photosynthetic pigment content, antioxidant enzyme activity gradually increased under Ca2+treatment, showing that Ca2+is propitious to relieve inhibitory effect on photosynthesis and enhance resistance to UV-B stress. Moreover, Ca2+reduced the content of nitrate nitrogen significantly, promoted the contents of free amino acids, soluble proteins, atropine alkaloids, and raised the activities of key enzymes in nitrogen metabolism. Using real-time fluorescence quantitative PCR, we found that exogenous Ca2+increased the relative gene expression levels of three key enzymes in secondary metabolism in different degrees. This research could provide a theoretical references for plantation in the field.

UV-B stress;L.; physiological characteristics; nitrogen metabolism; tropane alkaloids

2018-01-15;

2018-07-20;

2018-08-01.

10.3724/SP.J.1006.2018.01527

吳能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn, Tel: 023-68252147

E-mail: lukehuan@163.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500041)和重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2012gg-yyjs80013)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30500041) and the Science Technology Breakthrough Plan Project of Chongqing (cstc2012gg-yyjs80013).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180731.1057.002.html