白冬梅 薛云云 趙姣姣 黃 莉 田躍霞 權(quán)寶全 姜慧芳,*

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山西花生地方品種芽期耐寒性鑒定及SSR遺傳多樣性

白冬梅1,*薛云云1趙姣姣2黃 莉2田躍霞1權(quán)寶全1姜慧芳2,*

1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 山西汾陽(yáng) 032200;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所, 湖北武漢 430062

低溫寒害是引起花生產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要因素之一, 培育和種植高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)耐寒性強(qiáng)的品種是降低低溫寒害的理想途徑。然而高耐寒性種質(zhì)的缺乏和耐寒性鑒定的困難, 是限制耐寒性育種取得突破的主要原因。本研究對(duì)72份山西花生地方品種進(jìn)行芽期耐寒性鑒定, 以其相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)作為耐寒性評(píng)價(jià)指標(biāo), 初步將其分為高耐寒、耐寒、中感、敏感、高感5級(jí)。為了解山西花生地方品種耐寒性遺傳多樣性, 合理、高效利用耐寒型花生資源, 用多態(tài)性好的90對(duì)SSR引物評(píng)價(jià)了不同耐寒性花生品種, 結(jié)果顯示, 參試品種遺傳多樣性存在較大差異, 在遺傳距離為0.4時(shí), 被聚類為三大類群。3份高耐寒品種和7份耐寒品種分別聚類到不同的3個(gè)類群中, 說(shuō)明耐寒性花生遺傳多樣性豐富。

花生; 地方品種; 芽期耐寒性; 遺傳多樣性

花生(L)是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物, 在國(guó)內(nèi)大宗油料作物中, 單位面積產(chǎn)量、產(chǎn)油量、種植效益以及國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力等均具有明顯優(yōu)勢(shì)[1]。目前國(guó)內(nèi)食用油過(guò)度依賴進(jìn)口, 油脂供給安全問(wèn)題凸顯, 進(jìn)一步發(fā)展我國(guó)花生生產(chǎn), 拓寬花生種植區(qū)域, 是滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益、增加農(nóng)民收入的迫切需要[2]。然而, 在花生播種后常常遭遇低溫寒害, 種子活力受到損害, 出苗率明顯降低, 輕者延緩花生萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育, 重者發(fā)生大面積低溫爛種, 缺苗斷壟, 導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。高耐寒性種質(zhì)的缺乏和耐寒性鑒定的困難, 是限制耐寒性育種取得突破的主要原因之一。

山西省地處黃土高原, 大部分地區(qū)海拔在1500 m以上, 年平均氣溫3~14℃。山西省花生種植歷史悠久, 經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的自然訓(xùn)化和人工選擇, 孕育了豐富的變異類型和較強(qiáng)的抗逆性[3]。我們對(duì)山西省地方品種的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀詳細(xì)分析表明, 山西省花生地方品種具有豐富的遺傳多樣性[4-5]。本研究對(duì)72份山西省地方花生品種進(jìn)行了芽期耐寒性鑒定及SSR多態(tài)性檢測(cè), 分析研究其耐寒性遺傳多樣性, 為花生耐寒性育種及其相關(guān)研究提供了豐富的遺傳資源和重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試花生品種

本試驗(yàn)選取山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所花生課題組征集的72份山西花生地方品種, 其中普通型51份、多粒型11份、珍珠豆型10份, 其編號(hào)、品名、類型見(jiàn)表1。

表1 72份山西供試花生地方品種編號(hào)、品名、類型

1.2 芽期耐寒性鑒定

采用BIC-300人工氣候箱模擬大田氣象條件, 進(jìn)行芽期耐寒性篩選鑒定。選取2016年和2017年成熟飽滿、種皮完整、大小一致的種子20粒, 采用紙間發(fā)芽, 3次重復(fù), 常溫浸種8 h后放入12℃人工氣候箱培養(yǎng)72 h, 然后2℃低溫脅迫暗培養(yǎng)96 h, 再調(diào)到10℃暗培養(yǎng)72 h, 最后置于25℃人工氣候箱恒溫發(fā)芽, 以常溫浸種8 h后在25℃發(fā)芽為對(duì)照, 每天計(jì)錄發(fā)芽種子數(shù), 18 d后計(jì)算各品種的相對(duì)發(fā)芽率(%)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(GI), GI = ∑(Gt/Dt)。Gt為第天的發(fā)芽種子數(shù), Dt為相對(duì)應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

1.3 SSR引物及PCR擴(kuò)增

本研究在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所花生生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行, 所用的154對(duì)SSR引物由該實(shí)驗(yàn)室提供。選取花生健壯幼葉, 采用優(yōu)化的CTAB法[6]提取基因組DNA, 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量, 紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度并統(tǒng)一調(diào)整DNA濃度至100 ng L–1。PCR反應(yīng)體系為10 μL, 含Mix 2.5 μL (由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、ddH2O 5 μL、10~40 pmol L–1引物對(duì)0.5 μL、10~20 ng模板DNA 2 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min; 93℃變性30 s, 55~65℃(不同引物退火溫度不同)退火30 s, 72℃延伸1 min, 共32個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè), 硝酸銀染色, 顯影, 掃描保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果, 以0、1、C統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增帶型, 在相同遷移率位置上, 有帶記為“1”, 無(wú)帶記為“0”, 缺失記為“C”, 建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù), 用Microsoft Excel 2013處理基本數(shù)據(jù)。再根據(jù)不同分析軟件的格式要求作相應(yīng)轉(zhuǎn)換。用Powermarker-V 3.25 軟件[7-11]計(jì)算每對(duì)引物的多樣性參數(shù), 包括等位基因數(shù)()、主基因頻率(MAF)、基因多樣性指數(shù)()、多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC), 利用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析, 生成聚類圖; 用Popgene Ver.1.32 分析Shannon’s信息指數(shù)(I)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽期耐寒性品種分析

吸脹后突遇低溫脅迫, 各種質(zhì)材料間表現(xiàn)出明顯的差異, 有的材料受低溫影響小, 能正常發(fā)芽, 生長(zhǎng)狀況良好。有的材料耐低溫能力很差, 低溫脅迫后, 種子霉?fàn)€, 不能正常發(fā)芽生長(zhǎng)。其他材料介于這兩種類型之間, 萌發(fā)情況參差不齊(圖1)。

圖1 低溫脅迫后部分花生品種萌發(fā)情況

由表2可見(jiàn), 72份材料相對(duì)發(fā)芽率變幅范圍為6.86%~96.50%, 相對(duì)發(fā)芽指數(shù)變幅范圍為12.87%~ 94.46%, 表現(xiàn)最好的臨縣多粒、新降大花生、榆次花生3份材料的相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均>90%, 可作為高耐寒材料; 而表現(xiàn)最差的2份材料侯馬大粒和文水多粒的相對(duì)發(fā)芽率低于10%, 相對(duì)發(fā)芽指數(shù)低于20%, 可作為高感材料。按照相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)的變幅范圍, 將參試的72份材料耐寒性分為5級(jí)。一級(jí)為高耐寒材料, 相對(duì)發(fā)芽率與相對(duì)發(fā)芽指數(shù)均>90%, 有3份, 占總材料的4.17%, 其中珍珠豆型1份, 普通型2份; 二級(jí)為耐寒材料, 相對(duì)發(fā)芽率>90%, 80%<相對(duì)發(fā)芽指數(shù)<90%, 有7份, 占總材料的9.72%, 其中珍珠豆型1份, 多粒型3份, 普通型3份; 三級(jí)為中間材料, 50%<相對(duì)發(fā)芽率<90%, 50%<相對(duì)發(fā)芽指數(shù)<80%, 有17份, 占總材料的23.61%, 其中有珍珠豆型1份, 多粒型2份, 普通型14份; 四級(jí)為敏感材料, 10%<相對(duì)發(fā)芽率<50%, 20%<相對(duì)發(fā)芽指數(shù)<50%, 有43份, 占總材料的59.72%, 其中珍珠豆型7份, 多粒型5份, 普通型31份; 五級(jí)為高感材料, 相對(duì)發(fā)芽率<10%, 相對(duì)發(fā)芽指數(shù)<20%, 有2份, 占總材料的2.78%, 其中多粒型1份, 普通型1份。四級(jí)和五級(jí)材料受低溫脅迫, 種子霉?fàn)€, 活力喪失, 不能正常發(fā)芽生長(zhǎng), 嚴(yán)重影響出苗, 形成田間缺苗斷壟影響產(chǎn)量。鑒定篩選出的高耐寒和耐寒材料中, 包括2份珍珠豆型, 3份多粒型, 5份普通型, 說(shuō)明花生耐寒性與品種植物學(xué)屬性關(guān)系不大。

表2 供試品種的耐寒性鑒定

(續(xù)表2)

2.2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

選用8份不同地理來(lái)源、不同類型的花生品種基因組DNA, 用154對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。有101對(duì)引物擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰可辨的譜帶, 有效擴(kuò)增比率為47.3%, 其中90對(duì)具有多態(tài)性, 多態(tài)性引物比率為89.1% (圖2)。最終確定了譜帶清晰穩(wěn)定且具多態(tài)性的90對(duì)SSR引物用于本研究。

從表3可以看出, 72份山西省地方品種在90個(gè)SSR標(biāo)記中擴(kuò)增出317個(gè)等位基因數(shù)(), 每對(duì)引物平均擴(kuò)增出3.5222個(gè)等位基因, 不同引物每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)差異很大, 變化范圍2~8個(gè), 檢測(cè)到的等位基因最多的引物是A07B516和A08A90A。主基因頻率(MAF)變化幅度為0.2917 (A07B34)~ 0.8986 (A02B62), 平均0.6834?；蚨鄻有灾笖?shù)(GD)變化幅度為0.1823 (A02B62)~0.7711 (A08A90), 平均0.4537; 多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)變異范圍為0.1657 (A02B62)~0.7378 (A08A90), 平均0.4047; Shannon’s信息指數(shù)(I)變異范圍為0.3283 (A02B62)~ 1.6734 (A08A90), 平均0.8092。表明本研究所用的SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性豐富, 顯示山西省花生地方品種遺傳多樣性方面存在較大差異。其中16對(duì)引物最有效, Shannon’s信息指數(shù)均在1以上, 綜合比較各參數(shù), 等位基因數(shù)值多的SSR位點(diǎn), 基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)的值也大, 三者變化趨勢(shì)一致, 因此, 基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)對(duì)于遺傳多樣性分析, 更具有可靠的實(shí)際意義。

圖2 引物A06B209在72份花生品種中的擴(kuò)增

表3 90個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)

2.3 不同耐寒性花生品種的遺傳多樣性

根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù), 利用Powermarker-V3.25軟件, 采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析表明, 72份參試材料在遺傳距離為0.4時(shí), 被分為三大類群。第I類群是以多粒型為主的10個(gè)品種, 其中包括2份耐寒材料; 第II類是以普通型為主51個(gè)品種, 其中包括2份高耐寒材料和3份耐寒材料; 第III類是以珍珠豆型為主的11個(gè)品種, 其中包括1份高耐寒材料和2份耐寒材料, 說(shuō)明花生耐寒性遺傳多樣性豐富(圖3)。耐寒品種汾西小粒和長(zhǎng)子花生親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 而高耐寒品種新降大花生和高感品種侯馬大粒親緣關(guān)系最近, 說(shuō)明高耐品種和高感品種并不是親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 耐寒品種間也不是親緣關(guān)系最近。

3 討論

花生芽期寒害是引起花生產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要因素之一, 山西地處黃土高原高海撥區(qū), 其地方品種具有豐富的遺傳多樣性, 可能蘊(yùn)含著高耐寒型基因。因此, 本研究以山西花生地方品種為試驗(yàn)材料, 采用人工氣候箱中模擬大田氣象條件, 可以不受季節(jié)氣候條件等因素的限制而開展鑒定工作, 從而加快鑒定進(jìn)度。而且人工氣候箱設(shè)備的培養(yǎng)條件(光照、溫度、水分等)易于控制且重復(fù)性好, 鑒定出的耐寒性花生品種在田間更具有適應(yīng)性。本研究中耐寒性鑒定設(shè)置了2℃低溫脅迫, 這是經(jīng)過(guò)多次的、幾個(gè)溫度梯度的試驗(yàn)得出來(lái)的結(jié)果, 溫度低于2℃, 多數(shù)試材會(huì)被淘汰, 溫度高會(huì)出現(xiàn)大部分材料的正常發(fā)芽出苗而達(dá)不到選擇的目的, 這與封海勝[12]所做的花生種子吸脹期間耐低溫性鑒定是一致的。劉海龍等[13]利用花生種質(zhì)資源耐低溫表型方法鑒定花生種質(zhì)資源耐低溫屬性。呂建偉等[14]以花生相對(duì)出苗率將花生種質(zhì)資源劃分為不耐、低耐、中耐、高耐4個(gè)等級(jí)。唐月異等[15]以露白率及芽長(zhǎng)/種長(zhǎng)作為鑒定花生吸脹期耐寒性的指標(biāo)。目前對(duì)于花生不同階段耐寒性評(píng)價(jià)沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn), 本研究結(jié)合前人研究基礎(chǔ), 把相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)作為鑒定花生品種芽期耐寒性的指標(biāo), 初步將72份花生品種耐寒性分為高耐寒、耐寒、中感、敏感、高感5級(jí)。本研究鑒定篩選出的高耐寒和耐寒材料中, 包括2份珍珠豆型、3份多粒型和5份普通型, 表明花生耐寒性與品種植物學(xué)屬性關(guān)系不大, 這與唐月異等[15]研究得出的結(jié)論一致。常碩其等[16]對(duì)雜交品種親本及后代進(jìn)行耐寒性鑒定時(shí), 發(fā)現(xiàn)水稻的耐寒性是可以通過(guò)雜交穩(wěn)定遺傳的, 后代與親本的耐寒性呈正相關(guān)。康旭梅等[17]提出, 在綜合考慮后代優(yōu)良性狀的同時(shí), 只要保證親本之一的耐寒性較強(qiáng), 就有可能保證F1耐寒性強(qiáng)且具有優(yōu)良的綜合性狀。這些研究足以證明篩選耐寒性資源作為雜交親本培育耐寒性雜交后代的育種方法是完全可行的。本研究篩選出的臨縣多粒、新降大花生、榆次花生等耐寒品種可以作為親本進(jìn)行雜交培養(yǎng)耐寒性后代, 為選育高產(chǎn)高油酸耐寒性強(qiáng)新品種及其相關(guān)研究提供材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

圖3 基于SSR標(biāo)記的72份山西花生地方品種的聚類分析圖

分子標(biāo)記是揭示花生遺傳多樣性的有效手段, 國(guó)內(nèi)外研究者曾用RAPD[18]、SSR[19-26]、AFLP[27-28]等分子標(biāo)記對(duì)花生種質(zhì)資源遺傳多樣性廣泛研究。其中, SSR 以共顯性好、多態(tài)性豐富成為花生最實(shí)用的檢測(cè)標(biāo)記。本研究所用的SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性豐富, 顯示出山西省花生地方種質(zhì)資源遺傳多樣性方面存在較大差異。綜合比較各遺傳參數(shù), 等位基因數(shù)值多的SSR位點(diǎn), 基因多樣性指數(shù)(GD)、多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)和Shannon’s信息指數(shù)()的值也大, 三者變化趨勢(shì)一致。因此, 基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)對(duì)于遺傳多樣性分析, 更具有可靠的實(shí)際意義, 這一結(jié)果與花生[11]、豌豆[10,29-30]和小扁豆[31]上的研究結(jié)果一致。在遺傳距離為0.4時(shí), 參試品種被聚為三個(gè)類群, 類群I以多粒型為主, 類群II以普通型為主, 類群III是珍珠豆型為主, 說(shuō)明SSR 標(biāo)記的聚類與花生植物屬性關(guān)系密切, 與花生耐寒性特性和地域特性關(guān)系不大, 3份高耐寒品種和7份耐寒品種分布于3個(gè)不同的類群中, 這可能與控制耐寒性的遺傳因子在不同品種間存在差異有關(guān)。本研究所用材料僅限于山西省花生地方品種, 分析花生耐寒性遺傳特性的分子基礎(chǔ), 還需要更多的驗(yàn)證分析和豐富的育種材料, 以取得更加可靠的結(jié)果, 從而為花生耐寒性育種及其相關(guān)研究提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)72份山西地方品種芽期耐寒性鑒定, 初步篩選出3份高耐寒品種和7份耐寒品種, 分布在三個(gè)不同的類群中, 說(shuō)明花生耐寒品種遺傳多樣性豐富。

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Identification of Cold-tolerance During Germination Stage and Genetic Diversity of SSR Markers in Peanut Landraces of Shanxi Province

BAI Dong-Mei1,*, XUE Yun-Yun1, ZHAO Jiao-Jiao2, HUANG Li2, TIAN Yue-Xia1, QUAN Bao-Quan1, and JIANG Hui-Fang2,*

1Industrial Crops Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Fenyang 032200, Shanxi, China;2Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China

Cold injury is one of the main factors causing yield and quality decline in peanut. Cultivating and planting varieties with high and stable yield and strong cold tolerance is an ideal way to reduce cold injury, However, the lack of high cold tolerant germplasm and the difficulty of cold tolerance identification are the main reasons to limit the breakthrough of cold tolerance breeding. In this study, 72 local peanut varieties in Shanxi province were identified for cold tolerance at germination stage. Based on their relative germination rate and relative germination index, the cold tolerance of 72 peanut cultivars we preliminarily divided the 72 peanut cultivars into five grades, namely high-cold-tolerant type, cold-tolerant type, middle type, sensitive type, and high sensitive type. Ninety pairs of SSR primers with good polymorphism were used to evaluate the peanut cultivars with different cold-tolerance levels, and to examine the genetic diversity of cold-tolerant peanut landraces in Shanxi province making rational and efficient use of cold tolerant peanut resources. The tested cultivars were highly different in genetic diversity and were clustered into three groups with genetic distance of 0.4. Three high-cold-tolerant cultivars and seven cold-tolerant cultivars were clustered into three different groups, indicating that the cold-tolerant peanut varieties are rich in genetic diversity.

peanut; landraces; cold-tolerance at germination stage; genetic diversity

2018-02-24;

2018-06-12;

2018-07-03.

10.3724/SP.J.1006.2018.01459

白冬梅, E-mail: baidm1221@163.com; 姜慧芳, E-mail: peanut @oilcrops.com, Tel: 027-86711550

本研究由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13), 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物育種工程項(xiàng)目(17yzgc051)和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目(2017zzlx-07)資助。

This study was supported by the China Agricultural Research System (CARS-13), the Biological Breeding Project of Shanxi Academy of Agricultural Sciences (17yzgc051), and the Science and Technology Independent Innovation Ability Enhancement Project of Shanxi Academy of Agricultural Sciences (2017zzlx-07).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180702.1803.008.html