呂波，朱新鋒，蔡常春，鄭小林

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014）

胰腺癌是起源于胰腺導(dǎo)管上皮的腫瘤，惡性程度較高，5年生存率不到8%[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原蛋白（endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein，ERO1L）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的糖蛋白，具有氧化酶活性[2-3]。在低氧條件下可誘導(dǎo)其表達(dá)[4]。研究[4]顯示，ERO1L可調(diào)控低氧誘導(dǎo)的氧化蛋白的折疊。ERO1L參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7]。ERO1L能促進(jìn)乳腺癌的生長，加速乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，高表達(dá)ERO1L的乳腺癌患者預(yù)后極差[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，ERO1L在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌患者預(yù)后差相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，ERO1L作為一個(gè)癌基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要功能，然而ERO1L在胰腺癌中的表達(dá)情況及與臨床病理因素間的關(guān)系尚不清楚。本研究通過檢測ERO1L基因在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，分析ERO1L基因表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2013年1月—2015年12月在我院行胰腺癌切除手術(shù)的患者標(biāo)本85例，其中行55例行胰十二指腸切除術(shù)、30例行胰體尾切除術(shù)；68例病理類型為胰腺導(dǎo)管腺癌，14例為黏液癌，2例為腺鱗癌，1例為小細(xì)胞癌。另收集12例癌旁組織作為對照。所有病例標(biāo)本均保存于-80 ℃冰箱。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前未經(jīng)過放化療治療，所有標(biāo)本均具有完整臨床和隨訪資料；⑵ 所有病理樣本均由病理確診，診斷為胰腺癌；⑶ 均行手術(shù)治療。剔除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 隨訪資料或臨床資料不全者；⑵ 術(shù)前已行放化療者；⑶ 伴隨其他腫瘤者。剔除3例失訪病例，共94例（腫瘤82例，正常組織12例）樣本采用液氮研磨法提取中RNA，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量定量RCR（qRT-PCR）法分別檢測胰腺癌組織與癌旁組織中ERO1L mRNA表達(dá)量。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑TRIzol Universal購自天根生化科技（北京）有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Master Mix、熒光定量檢測試劑盒TB Green? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus),Bulk均購自Takara公司；ERO1L和GAPDH基因引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 ERO1L mRNA檢測及分組

采用q R T-P C R法。采用液氮研磨提取總RNA，將組織重液氮去除后迅速于預(yù)冷研缽研碎，加入1 mL TRIzol Universal提取試劑。取1 μg總mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA。ERO1L上游引物：5'-CCA TTA GTG CTG CCA ACC AGT A-3'，下游引物：5'-ATC TGC ATC AGC ATC ACG GTC-3'；GAPDH上游引物：5'-GGT GTG GCA TCA GGA TTC AAG-3'，下游引物5'-TTT CAT ACC GAT TGC TGT TGG A-3'，按說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，歸一化計(jì)算ERO1L mRNA在組織中的相對表達(dá)量。將所有胰腺癌組織中的ERO1L表達(dá)量取平均值，小于均值定義為ERO1L低表達(dá)組，共35例；大于平均值定義為ERO1L高表達(dá)組，共47例。統(tǒng)計(jì)分析ERO1L表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理因素及預(yù)后間的關(guān)系。

1.4 隨訪

所有患者經(jīng)門診或電話隨訪，每半年隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括患者的一般情況、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡情況。共隨訪85例患者，其中3例失訪，失訪率3.52%，共計(jì)82例入組研究。隨訪截止時(shí)間為2018年5月，平均隨訪時(shí)間（60.4±8.2）個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理采用獨(dú)立t檢驗(yàn)對組間進(jìn)行比較；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)?；颊呱嫫诤蜔o瘤生存期采用Kaplan-Meier分析，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測82例胰腺癌組織及12例癌旁組織中ERO1L mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織[（2.63±0.23）vs.（1.12±0.21），P＜0.01]（圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測胰腺癌及癌旁組織ERO1L mRNA表達(dá)水平Figure 1 ERO1L mRNA expression levels in pancreatic cancer tissue and adjacent normal pancreatic tissue determined by qRT-PCR

2.2 ERO1L mRNA表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理因素的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，ERO1L mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位無關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

表1 ERO1L mRNA表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of ERO1L mRNA expression with clinicopathologic factors in pancreatic cancer patients[n (%)]

2.3 ERO1L mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

ERO1L高表達(dá)組1年無瘤生存率為50.3%，ERO1L低表達(dá)組為71.4%，ERO1L高表達(dá)組1年無瘤生存率低于ERO1L低表達(dá)組（P＜0.01）；ERO1L高表達(dá)組3年無瘤生存率為3.2%，ERO1L低表達(dá)組3年無瘤生存率為21.8%，ERO1L高表達(dá)組3年無瘤生存率低于ERO1L低表達(dá)組（P＜0.01）（圖2 A）。E R O 1 L高表達(dá)組1年總生存率為57.3%，ERO1L低表達(dá)組1年總生存率為86.9%，E R O 1 L高表達(dá)組1年總生存率低于E R O 1 L低表達(dá)組（P＜0.01）；ERO1L高表達(dá)組3年總生存率為21.6%，ERO1L低表達(dá)組3年總生存率為57.1%，ERO1L高表達(dá)組3年總生存率低于ERO1L低表達(dá)組（P＜0.01）（圖2B）。

圖2 ERO1L高表達(dá)與低表達(dá)胰腺癌患者的生存曲線 A：無瘤生存曲線；B：總生存曲線Figure 2 Survival curves of pancreatic cancer patients with high or low ERO1L A: Disease-free survival curves; B: Overall survival curves

2.4 ERO1L mRNA表達(dá)為影響胰腺癌患者無瘤生存及總生存的危險(xiǎn)因素

單因素和多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為胰腺癌患者無瘤生存期（P=0.019）和總生存期（P=0.025）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素外，ERO1L表達(dá)也為判斷胰腺癌患者無瘤生存期（P=0.029）和總生存期（P=0.021）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2-3）。

表2 單因素及多因素分析胰腺癌患者無瘤生存期相關(guān)的危險(xiǎn)因子Table 2 Univariate and multivariate analyses of risk factors for tumor-free survival time in patients with pancreatic cancer

表3 單因素及多因素分析胰腺癌患者總生存期危險(xiǎn)因子Table 3 Univariate and multivariate analyses of risk factors for overall survival time in patients with pancreatic cancer

3 討 論

胰腺癌是一種高致死性腫瘤，預(yù)后極差[8-10]，流行病學(xué)研究[11-12]表明，到2030年胰腺癌將超過乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，成為第二大致死性腫瘤。研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找診斷治療胰腺癌的靶標(biāo)仍是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

ERO1L基因定位于人的第14號染色體，其轉(zhuǎn)錄翻譯后主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，具有氧化還原酶活性，調(diào)控由缺氧誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊[13]。ERO1L催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成并參與由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、炎癥及轉(zhuǎn)移過程[14-17]。Kukita等[18]發(fā)現(xiàn)ERO1L可通過氧化折疊調(diào)控I型MHC分子的表達(dá)。Hsu等[19]通過蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)ERO1L高表達(dá)于肺癌組織中，并與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于的癌旁組織，結(jié)合臨床病理因素分析發(fā)現(xiàn)，ERO1L mRNA高表達(dá)的胰腺癌患者與惡性的臨床病理因素相關(guān)，且ERO1L mRNA高表達(dá)的胰腺癌患者其無瘤生存率和總生存時(shí)間均顯著低于低表達(dá)組患者，這與其他腫瘤中的研究結(jié)果一致。關(guān)于ERO1L在人類腫瘤中的作用機(jī)制報(bào)道相對較少，Tsutomu等[20]的發(fā)現(xiàn)，ERO1L可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長及血管生成，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ERO1L通過影響血管內(nèi)皮生長因子氧化蛋白折疊進(jìn)而調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子的mRNA表達(dá)。在小鼠乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ERO1L可抑制免疫T細(xì)胞抗腫瘤活性[21]。在胰腺癌[22]的功能研究中，發(fā)現(xiàn)ERO1L作為一個(gè)癌基因通過激活Wnt/catenin信號通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但并沒有通過臨床病例標(biāo)本研究ERO1L基因表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

在本研究中，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)量與患者臨床病理因素，如患者臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)，這些惡性病理特征正是腫瘤難以治愈，術(shù)后易復(fù)發(fā)、致死率高的主要原因。ERO1L mRNA低表達(dá)組患者術(shù)后復(fù)發(fā)幾率較小，總生存時(shí)間顯著長于ERO1L mRNA高表達(dá)組患者。ERO1L高表達(dá)組1、3年無瘤生存率低于ERO1L低表達(dá)組。單因素和多因素分析示ERO1L mRNA高表達(dá)可作為判斷胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，這與ERO1L在其他腫瘤中的報(bào)道一致。以上結(jié)果提示ERO1L在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其表達(dá)水平可作為判斷胰腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

本研究也存在一定的不足之處，比如研究僅限于ERO1L基因與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系研究，然而該基因是如何影響患者預(yù)后的機(jī)制尚不清楚，根據(jù)本研究結(jié)果，如ERO1L基因高表達(dá)的胰腺癌患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，筆者推測ERO1L可能參與了胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，具體的機(jī)制還有待后續(xù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來揭示。

綜上，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中高表達(dá)，ERO1L mRNA高表達(dá)與胰腺癌惡性臨床病理因素及預(yù)后差相關(guān)。檢測ERO1L基因的表達(dá)水平可作為判斷胰腺癌患者不良預(yù)后的重要指標(biāo)，進(jìn)一步深入研究ERO1L在胰腺癌中的作用機(jī)制將有待助于指導(dǎo)胰腺癌治療及開發(fā)新的治療靶點(diǎn)。