吳邱紅，賈艾敏，袁佳利，劉 靜，楊明輝，陳 勇，袁國華

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)、多臟器損害的高異質(zhì)性、慢性自身免疫性疾病，其特征性免疫學(xué)改變是體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體。研究顯示，自噬在抗原多肽提呈過程中發(fā)揮重要作用[1]。自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程，可分為3種主要方式：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。自噬過程中有一系列相關(guān)蛋白的參與，其中微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein type-2，LAMP-2)分別是巨自噬和CMA的標(biāo)志物[2]。為探討巨自噬和CMA在SLE病變過程中的作用，本研究采用實(shí)時定量PCR方法檢測SLE患者外周血單個核白細(xì)胞(peripheral blood mono-nuclear cells，PBMCs)LC3和LAMP-2 在mRNA水平的表達(dá)，分析其與SLE的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對象

納入2017年11月至2018年3月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診治的SLE患者88例，其中男4例，女84例；患者年齡10～60歲，平均35歲；病程2～240個月，中位病程68個月。納入患者的診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(Ameri-can Rheumatic Society，ARA)制定的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[3]，采用SLE疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)積分判斷疾病活動度。選擇性別、年齡匹配的健康體檢者40例作為正常對照組，其中男3例，女37例；受檢者年齡15～60歲，平均34.5歲。本研究遵循人體受試者道德倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，研究方案得到川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：20170128)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及設(shè)備

人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；總RNA抽提試劑Trizol(美國Ambion公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)。實(shí)時定量PCR擴(kuò)增體系(Quant Studio12K Flex實(shí)時定量PCR 儀，美國ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBMCs的分離：采集受試者晨起外周靜脈血各5 ml，以乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)-K2抗凝。按照操作說明用Ficoll-Hypaque密度梯度離心，分離收集PBMCs。

1.3.2 總RNA提取和cDNA合成：用Trizol試劑按照說明提取總RNA，所提取RNA溶于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的去離子水中，紫外分光光度法分析純度和濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，選擇oligo(dT)18引物吸取12 μL RNA溶液，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR法測定目的基因表達(dá)：實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參Actin和目的基因引物設(shè)計(jì)與合成見表1。SYBR green實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，其中ddH2O 8.1 μl，SYBR混合物10.1 μl，正向引物(10 μmol/L)0.4 μl，反向引物(10 μmol/L)0.4 μl，cDNA 1 μl。PCR 循環(huán)條件：95 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)14 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)在ABI QuantStudio12K Flex定量熒光PCR儀上進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)立無模板對照，標(biāo)本和對照均做復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)果為每個反應(yīng)管內(nèi)的目標(biāo)基因熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值減去內(nèi)參Actin的Ct 值(△Ct值)，計(jì)算RQ值(RQ=2-△△Ct)，作為目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 SLE患者PBMCs中LC3和LAMP-2在mRNA水平的表達(dá)與臨床特征及治療效果關(guān)系評估：以健康對照組受檢者PBMCs中LC3和LAMP-2在mRNA 水平的平均相對表達(dá)量作為基線，LC3 mRNA相對表達(dá)量低于均值-SD者(即<0.47)定義為表達(dá)量降低，LAMP-2 mRNA 相對表達(dá)量>均值+2SD(即>2.35)者定義為表達(dá)量增高，對具有不同LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA表達(dá)水平患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行評估。SLE患者出現(xiàn)下列任一項(xiàng)表現(xiàn)者定義為腎損害：(1)尿蛋白定量>0.5 g/24 h或4 mg/(kg·h)；(2)離心尿紅細(xì)胞>5個/HPF；(3)腎功能異常(包括腎小球和/或腎小管功能)；(4)腎組織活檢異常。患者主要采用糖皮質(zhì)激素、羥氯喹和免疫抑制劑治療，后者包括環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)、硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)、他克莫司、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)。對不同LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA表達(dá)組患者腎損害發(fā)生率和治療效果進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SLE患者PBMCs中LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA相對表達(dá)量變化

SLE患者PBMCs中LC3 mRNA相對表達(dá)量為0.783±0.435，明顯低于正常對照組的1.021±0.551，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.323，P=0.02); SLE患者PBMCs中LAMP-2 mRNA相對表達(dá)量為2.402±2.233，明顯高于正常對照組的1.015±0.667，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.542，P=0.000)(圖1)。

圖 1 兩組受試者PMBCs中LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA表達(dá)量比較Fig 1 Comparison of LC3 mRNA and LAMP-2 mRNA in PBMCs between two groups

表1 引物序列Table 1 Sequence of target genes

2.2 SLE患者PBMC中LC3和LAMP-2 mRNA表達(dá)與SLEDAI的關(guān)系

SLE患者SLEDAI為4 (2，8)，PBMCs中LC3 mRNA相對表達(dá)量與SLEDAI呈明顯負(fù)相關(guān)(rs=-0.175，P=0.103)，PBMCs中LAMP-2 mRNA相對表達(dá)量與SLEDAI呈明顯正相關(guān)(rs=0.312，P=0.003)(圖2)。

2.3 SLE患者PBMCs中LC3和LAMP-2在mRNA水平表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

LAMP-2 mRNA相對表達(dá)量升高的SLE患者腎臟損害發(fā)生率分別高于LAMP-2 mRNA相對表達(dá)量未升高者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013、0.004)； LC3 mRNA相對表達(dá)量降低患者的血液系統(tǒng)受累率為65.2%，明顯高于無LC3 mRNA相對表達(dá)量降低患者的32.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。不同LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA表達(dá)組間患者的其他相關(guān)臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)以及糖皮質(zhì)激素、羥基氯喹和免疫抑制劑使用情況的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討論

SLE是自身免疫性疾病，其病理機(jī)制為患者體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，并由此誘發(fā)針對自身組織或器官的系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致靶組織或器官損傷。眾所周知，抗體(包括自身抗體)的產(chǎn)生需首先經(jīng)抗原加工處理，然后提呈給T淋巴細(xì)胞，才能誘導(dǎo)相應(yīng)抗體的產(chǎn)生。研究證實(shí)，抗原的加工處理階段主要發(fā)生在自噬溶酶體內(nèi)，因而自噬在免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫反應(yīng)的發(fā)生中具有重要作用，其功能異常與多種自身免疫性疾病有關(guān)，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Cronhn病和SLE[4]。

自噬是除凋亡外生命科學(xué)領(lǐng)域中研討的熱點(diǎn)，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體內(nèi)的方式不同，哺乳動物細(xì)胞的自噬可分為微自噬、巨自噬和CMA 3種主要方式，目前自噬與疾病的關(guān)系研究主要集中在后2種自噬方式。巨自噬起始于雙膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，在哺乳動物的自噬泡形成過程中LC3修飾過程發(fā)揮至關(guān)重要的作用，對自噬泡的形成必不可少，因而可作為巨自噬的特征性標(biāo)志物。CMA則是通過分子伴侶識別底物蛋白，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解。首先，分子伴侶蛋白HSPA8/ HSC70選擇性識別底物蛋白中的特定氨基酸序列KFERQ并與之結(jié)合成復(fù)合物，同時在HSP40、HSP90和Hip等分子的幫助下使底物蛋白質(zhì)去折疊。然后，該復(fù)合物與溶酶體膜表面受體LAMP-2結(jié)合而轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解，目前主要通過LAMP-2表達(dá)檢測CMA。

有研究顯示，LC3和LAMP-2 在mRNA水平的表達(dá)分別與巨自噬和CMA的發(fā)生率呈正相關(guān)[5]，本研究對SLE患者LC3和LAMP-2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量檢測，對巨自噬和CMA在SLE病變過程中的作用進(jìn)行探討。結(jié)果顯示， SLE患者PBMCs中LC3 mRNA的表達(dá)明顯低于正常對照組，而LAMP-2 mRNA表達(dá)則顯著高于正常對照組，提示SLE患者巨自噬功能可能降低，而CMA功能則可能增強(qiáng)。

巨自噬與SLE的相關(guān)性研究已有報道。Clarke等[6]研究發(fā)現(xiàn)，巨自噬在SLE患者的B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中發(fā)生率增高，Alessandri等[7]的研究則顯示SLE患者外周血T細(xì)胞巨自噬發(fā)生率與正常人比較無明顯差異，但SLE患者T細(xì)胞對自噬誘導(dǎo)的刺激反應(yīng)性下降。本研究對SLE患者的PBMCs(單核細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞)中LC3表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示LC3 mRNA表達(dá)降低，與筆者在另一組56例SLE患者中觀察到的結(jié)果一致，而且這個結(jié)果與采用Cyto-IDR自噬檢測試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞分析技術(shù)(免疫熒光法)檢測的PBMCs自噬發(fā)生率呈正相關(guān)[8]，提示SLE患者可能存在總體巨自噬功能的相對不足。研究證實(shí)臨床常用的SLE治療藥物糖皮質(zhì)激素可促進(jìn)T細(xì)胞巨自噬的發(fā)生[9]，而動物和臨床試驗(yàn)均證實(shí)，用巨自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、sirolimus等治療方法重塑巨自噬功能可顯著減少自身抗體、減少血管炎和腎臟損害的發(fā)生率[10-11]。這些結(jié)果均支持本研究觀察到的SLE存在巨自噬功能不足的結(jié)果。

圖 2 患者PBMCs中LC3 mRNA表達(dá)與SLEDAI相關(guān)性分析結(jié)果Fig 2 Correlation between expression level of LC3 mRNA in PBMCs and SLEDAI

表2 不同LC3 mRNA和LAMP2 mRNA表達(dá)水平的SLE患者臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果Table 2 Clinical menifastetions and laboratory results in SLE patients with different expression levels of LC3 mRNA and LAMP2 mRNA

CMA在抗原的加工處理和提呈中具有舉足輕重的作用，沉默LAMP-2表達(dá)可減少人B細(xì)胞系提呈內(nèi)源性抗原，而LAMP-2過度表達(dá)則可增加抗原的提呈量。目前CMA在SLE發(fā)病中的作用主要基于動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Page等[12]在對SLE易患鼠(MRL/lpr)D的研究中發(fā)現(xiàn)，CMA的標(biāo)志物L(fēng)AMP-2在MRL/lpr脾臟B細(xì)胞中過度表達(dá)，表明SLE存在CMA活性的變化，說明CMA在SLE發(fā)病過程起著極為重要的作用。有關(guān)CMA在SLE患者的發(fā)生過程中的作用目前報道甚少。本研究對SLE患者的CMA標(biāo)志物L(fēng)AMP-2 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，提示CMA在SLE患者的PBMCs中可能增高，極有可能成為治療SLE的靶點(diǎn)。雖然有報道顯示前列腺癌中LAMP-2 mRNA表達(dá)與CMA呈正比[13]，但在SLE的PBMCs中LAMP-2 mRNA表達(dá)能否正確反映CMA的發(fā)生情況尚需通過分離溶酶體、采用Western blot檢則LAMP-2蛋白的表達(dá)等有待進(jìn)一步加以證實(shí)。

本研究進(jìn)一步對SLE患者PBMCs中LC3和LAMP-2在mRNA水平的表達(dá)量與SLE臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析，顯示LC3 mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)，LAMP-2 mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈明顯正相關(guān)；LAMP-2 mRNA表達(dá)增高患者腎臟損害發(fā)生率明顯高于非增高患者， SLEDAI評分也明顯增高，而LC3 mRNA表達(dá)降低患者的血液系統(tǒng)受累明顯高于無LC3 mRNA表達(dá)降低患者，提示LC3表達(dá)降低或LAMP-2表達(dá)增高分別導(dǎo)致的巨自噬功能下降以及CMA的增強(qiáng)均參與SLE的病變過程。

總之，本研究通過檢測LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA的表達(dá)初步觀察SLE患者的自噬發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)巨自噬標(biāo)志物L(fēng)C3mRNA表達(dá)下降，而CMA特異性相關(guān)分子LAMP-2表達(dá)增高，提示SLE可能存在巨自噬相對不足及CMA功能相對增強(qiáng)，但尚需進(jìn)一步通過Western blot或免疫熒光技術(shù)對相應(yīng)分子的蛋白表達(dá)及自噬體的定位加以驗(yàn)證。