秦偉彤, 田 健, 伍寧豐

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

全細(xì)胞生物傳感器是以微生物全細(xì)胞作為分子識別敏感元件，感應(yīng)環(huán)境中的毒性物質(zhì)及污染物的裝置[1]。其由單一微生物的檢測方法到結(jié)合合成生物學(xué)、微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和工程學(xué)等形成的交叉學(xué)科經(jīng)歷了近30年的發(fā)展[2]。該類傳感器以活細(xì)胞作為感應(yīng)中心，當(dāng)有目標(biāo)毒性物質(zhì)存在時，會誘導(dǎo)報告基因(如綠色熒光蛋白基因、螢光素酶基因等)表達，并產(chǎn)生可測量的信號，從而達到檢測環(huán)境中毒性物質(zhì)的目的[3]。而其具有的響應(yīng)快、成本低、操作簡單、無需樣品預(yù)處理等優(yōu)勢，使檢測儀器的微型化、自動化和連續(xù)在線監(jiān)測成為可能。發(fā)展至今，全細(xì)胞生物傳感器一直是生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。全細(xì)胞生物傳感器目前主要用于檢測環(huán)境中的毒性物質(zhì)及動物源食品中的抗生素殘留[4]。在此，本文主要對全細(xì)胞生物傳感器的原理、分類進行綜述，并簡述其在環(huán)境監(jiān)測中的研究進展，以期為今后全細(xì)胞生物傳感器的開發(fā)與利用提供參考。

1 全細(xì)胞生物傳感器

1982年Quillardet等[2]進行的SOS顯色試驗，是第一個研究微生物報告基因的試驗，開創(chuàng)了全細(xì)胞生物傳感器的先河。隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，全細(xì)胞生物傳感器以其獨特的優(yōu)勢，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿3]。

1.1 全細(xì)胞生物傳感器的原理

全細(xì)胞生物傳感器以細(xì)菌為指示生物，利用一種或多種感應(yīng)和報告基因來產(chǎn)生出一種可識別并且可量化的產(chǎn)物[4](目前主要為熒光素酶)，具體如表1所示。其主要由2個部分組成：感應(yīng)元件和報告元件(圖1)。第一部分調(diào)節(jié)基因或啟動子能夠?qū)z測的物質(zhì)或其濃度的變化做出響應(yīng)，第二部分能夠?qū)z測到的化學(xué)信號轉(zhuǎn)換成可檢測的報告蛋白信號[12]，進而以報告蛋白的數(shù)量和活性作為細(xì)胞對靶目標(biāo)物的感應(yīng)指示。理想的報告蛋白應(yīng)具有高敏感性、易檢測、可定量的特點，且不會出現(xiàn)在原始菌種中[13]。全細(xì)胞微生物傳感器主要是為了檢測化學(xué)物質(zhì)和樣品的毒性，但研究表明，生物傳感器還有在其他領(lǐng)域應(yīng)用的可能性，如將不同的元件整合到生物傳感器上，當(dāng)信號輸出的時候能夠保證它是一個連續(xù)的反應(yīng)，就可以檢測細(xì)胞中積累的化合物的數(shù)量[14]。這種系統(tǒng)不僅能夠檢測化合物的濃度，還可以計算事件的數(shù)量。

圖1 全細(xì)胞生物傳感器示意圖Fig.1 Schematic of the whole-cell biosensor.

報告蛋白報告基因來源基質(zhì)參考文獻螢火蟲熒光素酶lucFF螢火蟲O2、ATP、熒光素[5]磕頭蟲熒光素酶lucGR磕頭蟲O2、ATP[6]海腎熒光素酶Rluc海腎腔腸素、Ca2+[7]β-半乳糖苷酶lacZ大腸桿菌糖苷[8]球形烯單氧酶crtA小紅卵菌屬球形烯[9]紅外熒光蛋白多種細(xì)菌光敏色素家族N/A[10]FMN-依賴的熒光素酶多種枯草芽孢桿菌和假單胞桿菌無[11]

1.2 全細(xì)胞生物傳感器的特點

全細(xì)胞生物傳感器以活細(xì)胞作為感應(yīng)元件，通常無需對樣品進行預(yù)處理，因而比傳統(tǒng)的檢測儀器更易攜帶，同時由于細(xì)胞繁殖速度快，其成本也更低[15]。此外，由于細(xì)胞響應(yīng)快、體積小，還可實現(xiàn)采樣點的原位檢測和實時監(jiān)測[16]。另一方面，細(xì)胞內(nèi)表達調(diào)控的變化是由對檢測物的感應(yīng)引起的，因此，全細(xì)胞生物傳感器還可分析待測物質(zhì)是否可在生物體內(nèi)代謝與利用等信息[17]。全細(xì)胞生物傳感器所用細(xì)菌主要分為2種：①對有毒物質(zhì)敏感的天然發(fā)光菌株，如熒光假單胞菌，從20世紀(jì)80年代就開始了對該類菌株發(fā)光能力的檢測實驗，當(dāng)這類細(xì)菌感應(yīng)到有毒物質(zhì)后，它發(fā)出的熒光就會有所變化，因此可利用這些天然生物熒光來評估樣品的毒性。這種檢測充分利用了生物發(fā)光需要能量和輔因子的特點，任何一個微小的熒光變化都預(yù)示著細(xì)胞正暴露在毒性環(huán)境中，使得檢測更加靈敏[18]。②導(dǎo)入報告基因(如綠色熒光蛋白基因)及含有受有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的啟動子和相關(guān)調(diào)節(jié)基因的基因工程菌株(通常以大腸桿菌為宿主進行改造)，基因工程手段的應(yīng)用使全細(xì)胞生物傳感器的類型更為多樣化，并具有更多的可能[19]。

2 全細(xì)胞生物傳感器的種類

根據(jù)所檢測的物質(zhì)及啟動子類型的不同，全細(xì)胞生物傳感器主要分為2類：非特異性全細(xì)胞生物傳感器(組成型)和特異性全細(xì)胞生物傳感器(誘導(dǎo)型)[20]。特異性全細(xì)胞生物傳感器中根據(jù)檢測物質(zhì)的不同又可細(xì)分為毒性或壓力應(yīng)答生物傳感器、金屬離子生物傳感器、特定化合物生物傳感器[21]。

2.1 非特異性全細(xì)胞生物傳感器

非特異性生物傳感器主要檢測環(huán)境中的總有毒物質(zhì)，無法具體到某一特定物質(zhì)。在無毒性物質(zhì)存在的條件下，報告基因能夠連續(xù)表達并產(chǎn)生信號，一旦有毒性物質(zhì)存在，細(xì)胞的生長受到抑制，信號減弱，從而達到測定總毒性物質(zhì)的效應(yīng)。但由于測定環(huán)境的復(fù)雜性，細(xì)胞易受到外界因素的影響，因此會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[22]。

2.2 特異性全細(xì)胞生物傳感器

特異性全細(xì)胞生物傳感器為誘導(dǎo)型的傳感器，即在某一種或某一類化合物(如重金屬、抗生素)的誘導(dǎo)下，啟動子被激活并使偶聯(lián)的報告基因表達。可將其細(xì)分為毒性或壓力應(yīng)答生物傳感器、金屬離子生物傳感器、特定化合物生物傳感器。

2.2.1毒性或壓力應(yīng)答生物傳感器 毒性或壓力應(yīng)答生物傳感器主要用于檢測某一類毒性物質(zhì)或脅迫壓力(如DNA損傷、蛋白質(zhì)損傷、膜損傷)[23,24]，在毒性物質(zhì)的刺激下，參與壓力反應(yīng)的啟動子被激活，進而使報告基因表達。一般選擇來自壓力應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵啟動子與不含啟動子的報告基因融合，然后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。其中應(yīng)用最為廣泛的是重組修復(fù)蛋白A(RecA)-LexA-調(diào)節(jié)的SOS壓力應(yīng)答系統(tǒng)，它檢測的是由化學(xué)物質(zhì)所誘導(dǎo)的DNA損傷[25]。大腸桿菌和鼠沙門傷寒菌的SOS響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中有幾十個基因，其中部分基因已經(jīng)成功地運用到毒性誘導(dǎo)報告基因表達中，如umuC、recN、sfiA、recA和cad[26,27]。除了這些基因，全基因組篩選策略也逐漸被應(yīng)用到篩選可用于此類傳感器的啟動子，如利用鳥槍法隨機篩選大腸桿菌染色體文庫的1.8 kb片段，將篩選到的片段與發(fā)光桿菌luxCDABE熒光素酶報告基因進行融合，最終用于標(biāo)準(zhǔn)壓力源的響應(yīng)及篩選[28]。此外，目前還有研究表明，將細(xì)胞暴露在壓力條件下，進行全基因組轉(zhuǎn)錄組分析，有助于篩選出新的用于毒性物質(zhì)感應(yīng)的啟動子[29]。

2.2.2金屬或類金屬傳感器 金屬傳感器一般由對某種或幾種重金屬離子敏感的操縱元件和報告單元2個部分組成，能夠?qū)μ囟ǖ闹亟饘匐x子進行響應(yīng)。其中，汞和砷的感應(yīng)報告菌株最先被開發(fā)出來[30]。汞傳感器由典型的大腸桿菌Tn21轉(zhuǎn)座子的mer操縱子(merTPCADE)、調(diào)節(jié)蛋白MerR連同1個merR-merT基因間的DNA(包括merRp和汞誘導(dǎo)的merTp30)組成。這個內(nèi)源性的MerR-merTp系統(tǒng)對汞具有高敏感性，檢測濃度最低可達1 fM[31]。而砷傳感器采用的是天然細(xì)菌對抗亞砷酸鹽和砷酸鹽的防御系統(tǒng)。大多數(shù)砷傳感器都包括起源于大腸桿菌質(zhì)粒R773和葡萄球菌質(zhì)粒pI258的Ars操縱子，其具體由用于檢測砷酸鹽的轉(zhuǎn)錄抑制子ArsR和受砷酸鹽自動調(diào)節(jié)的去阻遏的arsRp組成。但是，傳感器自身報告基因本底水平表達較高，這是由于它所采用的ArsR-arsRp通路具有可自動調(diào)節(jié)的ArsR[32]。Wackwitz等[33]通過在arsR基因的下游及報告基因的上游加入包含ArsR結(jié)合位點的第二個DNA片段，并對lacZ報告子的上游的核糖體結(jié)合位點進行一系列的修飾，在砷酸鹽不存在的情況下，獲得了低水平表達的報告基因。

2.2.3特定化合物生物傳感器 特定化合物一般包括無機物和有機物，其中靶向無機物的檢測通常是依賴于對其的直接響應(yīng)，無需某些中間產(chǎn)物的參與；而靶向有機物的檢測則是依賴于細(xì)胞分解代謝中調(diào)節(jié)蛋白和代謝化合物之間的相互作用。這種傳感器的組分都是從對特定的物質(zhì)(如有機物、抗生素等)表現(xiàn)出抗性機制的細(xì)菌中分離的，或者從一些能夠代謝毒性化合物(如萘、甲苯、苯酚)的菌株中分離得到的(表2)。如熒光假單胞桿菌萘傳感器中的NahR感應(yīng)蛋白，就是來源于細(xì)菌中的LysR-類型轉(zhuǎn)錄激活因子家族，它是原始熒光假單胞桿菌萘傳感器的延伸，靶向于單一的化合物或者一類化合物。實際上它的效應(yīng)化合物激活的調(diào)節(jié)蛋白并不是靶向化合物萘，而是在產(chǎn)生靶向物的代謝途徑中的中間產(chǎn)物水楊酸鹽[46]。另外一種應(yīng)用較廣泛的調(diào)節(jié)蛋白是XylR-DmpR、NtrC轉(zhuǎn)錄激活子的亞家族[47]，它們是多結(jié)構(gòu)域蛋白，當(dāng)被效應(yīng)物激活后，就能夠誘導(dǎo)依賴于RNA聚合酶σ因子的啟動子表達。

雖然可開發(fā)為信號通路的天然調(diào)節(jié)蛋白的種類較多，但由于它們的專一性并不足以檢測優(yōu)先污染物(一般指具有較強毒害性的物質(zhì))。在這種情況下，就會根據(jù)特定的靶向有機物，利用突變和合成生物學(xué)方法設(shè)計產(chǎn)生所需的檢測特異性。如XylR突變體用于感應(yīng)爆炸蒸氣中的二硝基甲苯(dinitrotoluene，DNT)，DmpR突變體用于感應(yīng)2,4-二氯苯酚，HbpR突變體通過識別2-氯聯(lián)苯來檢測多氯聯(lián)苯[48～50]。此外，DntR突變體能夠識別硝基甲苯、硝基苯甲酸鹽和苯酸鹽，也是通過定點突變實現(xiàn)的[51]。

表2 特定化合物生物傳感器種類Table 2 Species of specific compound biosensors.

3 全細(xì)胞生物傳感器在環(huán)境污染物監(jiān)測領(lǐng)域的應(yīng)用

全細(xì)胞生物傳感器可應(yīng)用于環(huán)境污染物和動物源食品中抗生素殘留的監(jiān)測、細(xì)胞壞死與凋亡的檢測、藥物研發(fā)、營養(yǎng)流行病學(xué)的研究等領(lǐng)域[52～54]，但其在環(huán)境污染物監(jiān)測領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛[55]。隨著基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，采用DNA重組技術(shù)對其進行改造而構(gòu)建基因工程菌株的研究策略應(yīng)用最多。Willardson等[56]最初采用DNA重組技術(shù)將XylR啟動子與熒光素酶基因進行融合，并導(dǎo)入到大腸桿菌中用于檢測污水及土壤樣本中的甲苯。而Kim等[42]構(gòu)建的含有CadC啟動子的重組質(zhì)粒能夠檢測樣本中重金屬Cd2+、Pb2+、Zn2+的含量。此外，在表2中也列舉了一些用于環(huán)境污染物檢測的全細(xì)胞生物傳感器，如甲苯、二甲苯、乙苯(通過XylR或TbuT檢測)、苯酚(DmpR檢測)、羥化聯(lián)苯(HbpR檢測)和菲(PhnR檢測)等。而在動物源食品中抗生素殘留檢測方面， Cheng等[57]篩選到1株對氟喹諾酮類藥物敏感的菌株E.colipK12，并建立了檢測肉蛋奶中11種氟喹諾酮類藥物的方法，具有高回收率、高敏感性等特點。

通常研究構(gòu)建的報告菌株在實驗條件下都具有良好的檢測效果，但若將其應(yīng)用于野外環(huán)境中污染物的檢測則必須考慮將全細(xì)胞束縛住，因此，必須將全細(xì)胞固定在某種介質(zhì)上，這樣既可保持微生物的活性，也能將信號進行轉(zhuǎn)換并放大。常用的固定方法有：利用瓊脂將微生物固定在微孔板的底部或?qū)⒕臧ぴ诠枘z中；通過硅藻土將微生物連接在光纖的末端[58]；利用納米技術(shù)進行細(xì)胞的固定[59,60]。如Mbeunkui等[61]將發(fā)光的大腸桿菌和釀酒酵母分別定植于高密度的微孔矩陣中，并采用相應(yīng)的可視化解碼系統(tǒng)，實現(xiàn)了不同細(xì)胞信號的測定。而Salalha等[62]利用納米技術(shù)將聚乙烯醇的液滴拉伸成非常細(xì)的納米纖維，對細(xì)胞進行固定。

細(xì)胞實現(xiàn)固定化后，則需考慮將產(chǎn)生的信號進行放大，而生物芯片技術(shù)是一項集生物、化學(xué)、物理、光學(xué)和微電子信息技術(shù)的綜合高新技術(shù)，它的出現(xiàn)使全細(xì)胞生物傳感器實現(xiàn)微型化和高通量化的目標(biāo)不再遙遠(yuǎn)。2002年Bolton等[63]構(gòu)建了第一個全細(xì)胞生物傳感器芯片，他們利用互補性金屬氧化半導(dǎo)體構(gòu)建了報告菌株的光信號整合回路系統(tǒng)，用以檢測經(jīng)水楊酸或萘誘導(dǎo)后報告菌株所產(chǎn)生的低水平光信號。因此，將報告菌株與生物芯片結(jié)合必將在后基因組時代的科學(xué)研究中發(fā)揮巨大作用。

同時，微生物電催化也是一個比較新的領(lǐng)域，其以微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝作為催化劑，結(jié)合電極共同完成信號的轉(zhuǎn)變，將全細(xì)胞與電化學(xué)的優(yōu)勢進行了充分結(jié)合[64,65]。如希瓦氏菌屬中的ShewanellaoneidensisMR-1可代謝多種電子受體，如甲苯、三氯乙酸、順丁烯二酸等環(huán)境污染物，因而，其在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大潛力[66,67]。2017年Si等[68]以ShewanellaoneidensisMR-1為識別元件，將電化學(xué)電極作為信號轉(zhuǎn)換元件制造出了全細(xì)胞電化學(xué)生物傳感器，用于測定水中的3,5-二氯酚，使得下游信號的檢測靈敏度得到提高并極大地降低了成本。

4 展望

全細(xì)胞生物傳感器發(fā)展至今，研究熱度持續(xù)增高。目前研究重點仍是報告菌株的優(yōu)化與改良，主要有以下幾個方向：①尋找對檢測物質(zhì)特異性較強及較敏感的調(diào)控元件[69]；②尋找易檢測且穩(wěn)定的報告基因[70]；③由于污染日趨嚴(yán)重、污染類型增多，構(gòu)建的基因工程報告菌株應(yīng)具有更強的抗性及更高的廣譜性[71]；④選擇合適的介質(zhì)使微生物能夠在較長時間內(nèi)保持活性。

因此，盡管對全細(xì)胞生物傳感器的研究已有幾十年，但是在生物傳感器菌株的構(gòu)建及其檢測性能方面還有較大的提升空間。除了技術(shù)上的阻礙，由于所研究菌株為轉(zhuǎn)基因菌株，還存在明顯的監(jiān)管問題，這就意味著它們的應(yīng)用只能限制在實驗室或特定環(huán)境中。因此，克服監(jiān)管障礙等問題，以及獲得國際的認(rèn)可十分必要。