劉 宇, 張 震, 丁倩雯, 李 解, 魯程瑤, 冉 超, 張洪玲, 張進(jìn)雄, 周志剛

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

2016年我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到5 142萬(wàn)t，約占全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的3/5，是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖集約化程度的提高，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，水產(chǎn)品的質(zhì)量也相應(yīng)地不斷下降[1]。研究者發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)作為腸道菌群在體內(nèi)發(fā)酵不易消化的碳水化合物產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝與免疫抗病有著重要的調(diào)控作用，作為新型飼料添加劑具有廣闊前景。 在哺乳動(dòng)物及水產(chǎn)動(dòng)物中主要存在的SCFAs有乙酸、丙酸、丁酸。研究者系統(tǒng)研究了SCFAs對(duì)哺乳動(dòng)物食欲、葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素分泌的影響[2,3]，并且認(rèn)為乙酸鹽是腸道微生物與宿主代謝的耦合點(diǎn)[4]，如Perry等[3]報(bào)道乙酸鹽會(huì)促進(jìn)小鼠攝食增加導(dǎo)致增重和胰島素抵抗。但在水產(chǎn)領(lǐng)域?qū)τ谝宜猁}等SCFAs的生產(chǎn)研究是相對(duì)滯后的。因此，對(duì)乙酸鹽等SCFAs對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控進(jìn)行研究是非常有必要的。

魚類養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的實(shí)現(xiàn)主要依賴于魚類的生長(zhǎng)，魚類的生長(zhǎng)與其攝食量密切相關(guān)，而食欲是決定動(dòng)物攝食量的一個(gè)重要因素，因此深入了解乙酸鹽等SCFAs對(duì)魚類食欲的影響，對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究表明高等動(dòng)物的攝食行為通過(guò)基因調(diào)控，這些基因作用于大腦中的攝食中心，可以分為促進(jìn)食欲的基因和抑制食欲的基因兩類[5]。例如，促食欲基因有下丘腦泌素(hypocretin neuropeptide，hcrt)、神經(jīng)肽 Y(neuropeptide Y，NPY)、饑餓素(ghrelin)等。抑制食欲基因有促胃液激素釋放肽 (gastrin-releasing peptide，Grp)、 可卡因苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)、黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortin 4 receptor，MC4r)等。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，對(duì)蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝有促進(jìn)合成的作用，因此對(duì)調(diào)控胰島素分泌的物質(zhì)進(jìn)行研究對(duì)于營(yíng)養(yǎng)代謝尤其重要。文獻(xiàn)報(bào)道，Glp-1、Nucb2a基因在胰島素分泌通路中起著重要的促進(jìn)作用[6～8]。而Goat基因?qū)σ葝u素分泌起著相反的作用[9]。

本研究以斑馬魚作為研究對(duì)象，通過(guò) RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，對(duì)經(jīng)腹腔注射乙酸鈉處理的斑馬魚食欲相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，從而探討了乙酸鈉對(duì)斑馬魚食欲的影響。進(jìn)一步分析腹腔注射乙酸鈉不同時(shí)間后不同組織胰島素分泌基因的影響，探討乙酸鈉對(duì)斑馬魚胰島素分泌的影響，為乙酸在水產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用成年斑馬魚，購(gòu)自北京花鳥市場(chǎng)。所購(gòu)斑馬魚在長(zhǎng)100 cm、寬60 cm、高50 cm、水體體積40 L的玻璃缸中暫養(yǎng)兩周，以消除應(yīng)激反應(yīng)，養(yǎng)殖條件控制水溫28℃，水中溶氧>6.0 mg/L，pH 7.0～7.2，氨氮含量<0.5 mg/L，14 h 光照，10 h 黑暗。在暫養(yǎng)期間，每天上午9：00 和下午4：00以商業(yè)飼料正常喂養(yǎng)。

1.2 注射試劑配制

將乙酸鈉溶于生理鹽水，并按如下濃度進(jìn)行配制：①生理鹽水；②生理鹽水+乙酸鈉(0.4 μmol/g)；③生理鹽水+乙酸鈉(0.8 μmol/g)；④生理鹽水+乙酸鈉(1.2 μmol/g)。

1.3 斑馬魚腹腔注射

實(shí)驗(yàn)開始的前一天，在上午10:00以商業(yè)飼料飼喂斑馬魚。在饑餓24 h后開始腹腔注射實(shí)驗(yàn)。將斑馬魚冰水浴麻醉，斑馬魚失去知覺后用微量進(jìn)樣器將不同濃度的乙酸鈉注射入斑馬魚腹腔。

1.4 斑馬魚注射后取樣

為統(tǒng)計(jì)斑馬魚注射后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)斑馬魚攝食基因、血糖含量、胰島素含量、胰島素分泌相關(guān)基因的變化情況，在斑馬魚注射乙酸鈉2 h、4 h、6 h后冰水浴麻醉斑馬魚，用消毒鑷子取肝、腦、腸組織置于無(wú)菌EP管中，放入液氮保存。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因的mRNA水平

取各組斑馬魚肝臟、腦、腸組織進(jìn)行RNA提取，總RNA提取采用Trizon Reagent提取的方法。反轉(zhuǎn)為cDNA后以其作為模板進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，熒光定量PCR引物如表1所示。反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，RNAase-free水6 μL。實(shí)時(shí)定量采用兩步PCR擴(kuò)增法，程序?yàn)椋?5℃ 10 s；95℃ 5 s ，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)獲得的信號(hào)和數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均來(lái)自至少3次以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，使用軟件Graphpad Prism 5.0或是Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(M ±SE)的形式進(jìn)行表示。采用t檢驗(yàn)比較不同組數(shù)據(jù)之間的差異。P<0.05時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，圖中以“*”標(biāo)記；P<0.01時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異，圖中以“**”標(biāo)記。

表1 斑馬魚引物序列Table 1 Zebrafish primer sequence.

2 結(jié)果與分析

2.1 腹腔注射乙酸鈉對(duì)斑馬魚促進(jìn)攝食基因表達(dá)量的影響

腹腔注射乙酸鈉2 h、4 h、6 h后取斑馬魚腦組織檢測(cè)攝食基因表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，在腹腔注射0.8 μmol/g乙酸鈉2 h后，npy基因表達(dá)水平提高了72.1%(P>0.05),4 h時(shí)npy基因表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著性變化，6 h時(shí)乙酸鈉0.8 μmol/g處理組npy基因表達(dá)量是對(duì)照組的1.6倍(P>0.05)。npy7R基因在2 h時(shí)未出現(xiàn)顯著性變化，4 h時(shí)0.4 μmol/g和1.2 μmol/g處理組表達(dá)量提高了87.2%和206.9%(P>0.05)。6 h時(shí)乙酸鈉1.2 μmol/g處理組npy7R表達(dá)量具有增加趨勢(shì)，其表達(dá)水平是對(duì)照組的2.8倍。ghre基因表達(dá)水平在2 h時(shí)未出現(xiàn)顯著性變化，在4 h時(shí)1.2 μmol/g處理組表達(dá)水平顯著性升高，是對(duì)照組的5.95倍(P<0.01)，6 h時(shí)1.2 μmol/g乙酸鈉注射組表達(dá)水平是對(duì)照組的5.16倍(P<0.01)。其他處理組未出現(xiàn)顯著性變化。

圖1 腹腔注射乙酸鈉對(duì)攝食基因表達(dá)水平的影響Fig.1 Effects of intraperitoneal injection of sodium acetate on the orexigenic gene expression levels.A.腦組織npy基因相對(duì)表達(dá)量；B.腦組織npy7R基因相對(duì)表達(dá)量；C.腦組織ghre基因相對(duì)表達(dá)量。**表示處理組與CK組相比，差異極顯著(P<0.01)。

圖2 腹腔注射乙酸鈉對(duì)抑制攝食基因表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of intraperitoneal injection of sodium acetate on the anorexigenic gene expression levels.A.腦組織cart基因相對(duì)表達(dá)量；B.腦組織grpr基因相對(duì)表達(dá)量；C.腦組織mc4R基因相對(duì)表達(dá)量

2.2 腹腔注射乙酸鈉對(duì)斑馬魚抑制攝食基因表達(dá)量的影響

檢測(cè)斑馬魚腦組織抑制攝食基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)(圖2)，cart基因表達(dá)量在2 h、4 h和6 h時(shí)未出現(xiàn)顯著性變化。grpr基因1.2 μmol/g處理組在2 h、4 h和6 h時(shí)表達(dá)水平都出現(xiàn)下降趨勢(shì)，2 h時(shí)grpr基因表達(dá)量下降了28.3%(P>0.05)，4 h時(shí)grpr基因相對(duì)表達(dá)水平降低了33.8%(P>0.05)，6 h時(shí)基因表達(dá)水平降低了25.4%(P>0.05)，而其他處理組未出現(xiàn)明顯變化。mc4R基因在2 h和4 h時(shí)未出現(xiàn)顯著性變化，在6 h時(shí)1.2 μmol/g乙酸鈉注射組mc4R基因表達(dá)水平提高了61.2%(P>0.05)。

2.3 腹腔注射乙酸鈉對(duì)斑馬魚胰島素分泌基因表達(dá)量的影響

2.3.1肝臟胰島素分泌基因表達(dá)量的變化 如圖3所示，檢測(cè)斑馬魚肝臟組織胰島素分泌基因的表達(dá)水平，glp-1基因在腹腔注射6 h后表達(dá)量顯著性上升，表達(dá)水平是對(duì)照組的2.1倍。nucb2a基因表達(dá)水平在1.2 μmol/g乙酸鈉腹腔注射6 h后出現(xiàn)顯著性上升，其表達(dá)水平提高了2.3倍(P<0.05)。1.2 μmol/g乙酸鈉注射組goat基因表達(dá)水平有提升趨勢(shì)，其表達(dá)量提高了6.5倍。4 h時(shí)不同濃度處理組未出現(xiàn)顯著性變化。6 h時(shí)0.4 μmol/g和1.2 μmol/g注射組goat基因表達(dá)水平顯著性提升，分別是對(duì)照組的7.6倍和13.1倍(P<0.05，P<0.01)。

2.3.2腸道胰島素分泌基因表達(dá)量的變化 檢測(cè)斑馬魚腸道胰島素分泌基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)(圖4)，促進(jìn)胰島素分泌基因glp-1在2 h時(shí)不同濃度處理組均顯著性提高，其中，0.4 μmol/g、0.8 μmol/g處理組glp-1表達(dá)量提高了3.6倍和2.6倍(P<0.05，P<0.05)，1.2 μmol/g乙酸鈉注射組glp-1表達(dá)量是對(duì)照組的3.5倍(P<0.05)。4 h時(shí)glp-1表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著變化，6 h時(shí)1.2 μmol/g處理組表達(dá)量有升高趨勢(shì)，提高了1.67倍(P>0.05)。nucb2a基因表達(dá)量在2 h時(shí)不同濃度處理組均出現(xiàn)不同程度的提高，0.4 μmol/g處理組表達(dá)水平提高了10.7倍(P>0.05)，0.8 μmol/g處理組表達(dá)水平提高了14.7倍(P>0.05),1.2 μmol/g處理組表達(dá)量是對(duì)照組的4.7倍(P>0.05)。乙酸鈉腹腔注射4 h時(shí)nucb2a基因表達(dá)水平出現(xiàn)上升趨勢(shì)，0.4 μmol/g、0.8 μmol/g和1.2 μmol/g分別提高了3.9倍、2.7倍和4.9倍(P>0.05)。6 h時(shí)1.2 μmol/g注射組基因表達(dá)水平提高了2.6倍(P<0.05)。goat基因腹腔注射2 h時(shí)0.4 μmol/g注射組表達(dá)量上升，其基因表達(dá)量是對(duì)照組的7.6倍(P<0.05)。0.8 μmol/g注射組表達(dá)量是對(duì)照組的20.9倍(P>0.05)。4 h時(shí)各處理組未出現(xiàn)顯著性變化。腹腔注射6 h時(shí)1.2 μmol/g處理組goat表達(dá)量提高了17.4倍(P>0.05)。

圖3 腹腔注射乙酸鈉肝組織胰島素分泌基因表達(dá)量的變化Fig.3 Insulin secretory gene expression in liver tissue after intraperitoneal injection of sodium acetate.A.肝組織glp-1基因相對(duì)表達(dá)量；B.肝組織nucb2a基因相對(duì)表達(dá)量；C.肝組織goat基因相對(duì)表達(dá)量。*和**分別表示處理組與CK組相比，在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

圖4 腹腔注射乙酸鈉腸組織胰島素分泌基因表達(dá)量Fig.4 Insulin secretory gene expression in intestine tissue after intraperitoneal injection of sodium acetate.A.腸組織glp-1基因相對(duì)表達(dá)量；B.腸組織nucb2a基因相對(duì)表達(dá)量；C.腸組織goat基因相對(duì)表達(dá)量。*表示處理組與CK組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

乙酸鈉經(jīng)腹腔注射入機(jī)體后，在4 h后即可提高斑馬魚促進(jìn)食欲基因的表達(dá)量，對(duì)抑制攝食基因表達(dá)量并無(wú)顯著性影響。同時(shí)，乙酸鈉能夠提高斑馬魚肝臟組織和腸組織促進(jìn)胰島素分泌基因的表達(dá)。并且腹腔注射乙酸鈉2 h后即可對(duì)斑馬魚腸組織胰島素分泌基因發(fā)揮調(diào)控作用，而斑馬魚肝臟組織則在腹腔注射6 h后對(duì)斑馬魚促進(jìn)胰島素分泌基因表達(dá)水平有著顯著性的提高。goat基因表達(dá)量的升高可能是機(jī)體對(duì)于促進(jìn)胰島素分泌基因表達(dá)水平的提高作出的反饋調(diào)節(jié)。同樣地，Perry 等[3]在小鼠中證實(shí)乙酸鹽會(huì)促進(jìn)小鼠攝食增加導(dǎo)致增重和胰島素抵抗。而相反的是Den等[10]添加5%(w/w)乙酸鈉到高脂飼料中，飼喂小鼠12周，動(dòng)物表現(xiàn)體重增加減少和改善的胰島素敏感性，沒有改變攝食量和身體活動(dòng)。Lu 等[11]證實(shí)用添加乙酸5%(w/w)的高脂飼料飼喂小鼠12周，會(huì)抑制體重增加，改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)，降低胰島素濃度。爭(zhēng)議結(jié)果的出現(xiàn)可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件等相關(guān)，人類實(shí)驗(yàn)的證據(jù)是有限的，需要我們進(jìn)一步的研究。

乙酸鹽在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究主要集中于對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的表型研究，SCFAs對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控作用研究較少。早前Ring?[12]報(bào)道1 g/kg的乙酸鈉作為飼料添加劑可以提高貝爾湖紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpinus)的增重率，并推測(cè)是由于飼料消化率的提高引起的。daSilva等[13]表明乙酸鈉對(duì)南美白對(duì)蝦的弧菌屬有較高的抑制能力，有利于水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)表現(xiàn)。隨著研究的發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)乙酸鹽對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)表現(xiàn)的提高可能是由于乙酸鹽對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物食欲及胰島素分泌的重要調(diào)節(jié)作用引起的，具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。