李彥虎, 牛耀星, 劉小霞, 郭 娟, 鄧展瑞, 贠建民

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730070

漿水是一種極具西北特色的傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)味食品，其釀造歷史悠久、制作工藝獨特，且具有口味香醇、口感酸爽、固形物酸脆可口等特點，深受西北地區(qū)民眾的喜愛[1～4]。目前，漿水釀造的主要方式是以家庭或小作坊式的自然發(fā)酵為主，產(chǎn)品受環(huán)境因素的影響較大，質(zhì)量不夠穩(wěn)定，同時，這也制約了漿水的工業(yè)化生產(chǎn)，難以實現(xiàn)傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)發(fā)酵食品向現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變[5]。而純種發(fā)酵劑的使用可有效保障、提升產(chǎn)品品質(zhì)。

目前，純種發(fā)酵劑已在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[6]。發(fā)酵劑可分為直投式發(fā)酵劑和非直投式發(fā)酵劑。非直投式發(fā)酵劑是指菌種經(jīng)過逐級擴大培養(yǎng)后再投入到生產(chǎn)中的發(fā)酵劑;而直投式發(fā)酵劑是指通過冷凍干燥技術(shù)得到高濃縮、標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)酵劑菌種，在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過傳代培養(yǎng)而直接投入到原料中進行發(fā)酵[7]。其中，直投式發(fā)酵劑是傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)發(fā)酵食品走向市場化的關(guān)鍵，一方面，直投式發(fā)酵劑能夠解決傳統(tǒng)發(fā)酵過程中發(fā)酵周期長、整個生產(chǎn)過程難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的問題[8]；另一方面，由于直投式發(fā)酵劑活菌含量高，可有效避免菌種退化以及活化、復(fù)壯過程中產(chǎn)生污染[9]。這將為中小型發(fā)酵食品廠提高產(chǎn)品品質(zhì)帶來實質(zhì)性的變革。

制備直投式發(fā)酵劑的關(guān)鍵在于冷凍保護劑的選擇。冷凍保護劑種類繁多，常見冷凍保護劑可分為兩類[10]，一類為小分子物質(zhì)：甘油、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、抗壞血酸等；另一類為大分子物質(zhì)：脫脂乳粉、抗性淀粉、乳清蛋白、麥芽糊精、吐溫80等。不同冷凍保護劑保護菌體細胞的機理不同，因此，在實際生產(chǎn)過程中不會單一使用，而是采取復(fù)配的形式保護菌體細胞[11]。研究表明，凍干保護劑：海藻糖、L-半胱氨酸、山梨醇、乙酸鈉單獨使用時，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的凍干菌劑存活率分別為75%、29%、67%、57%；而當(dāng)這些保護劑復(fù)配使用并加入脫脂奶粉后，干酪乳桿菌的凍干菌劑存活率高達98.74%，可見復(fù)配使用有利于提高菌體的存活率[12]。在各類凍干保護劑中，糖類的保護作用尤為明顯。Jofré等[13]已經(jīng)確定了糖類保護劑對微生物制劑(如酵母、細菌)有較好的保護作用；Lee等[14]的研究表明，制備釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D8凍干粉時加入海藻糖，可顯著提高D8的存活率。這些研究為凍干過程中提高菌體存活率提供了科學(xué)依據(jù)。

本實驗室前期已從甘肅天水傳統(tǒng)釀造漿水中分離篩選到一株產(chǎn)香風(fēng)味良好的酵母菌Y16，經(jīng)26S rDNA鑒定為異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)[15]。本研究以該菌株為供試菌株，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得高密度菌懸液后，利用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡實驗及響應(yīng)面方法(RSM)篩選出最佳保護劑配方，再運用冷凍真空干燥技術(shù)制備直投式增香發(fā)酵劑，以期為提高漿水品質(zhì)、改善風(fēng)味提供參考，為實現(xiàn)漿水工業(yè)化生產(chǎn)提供良好的增香發(fā)酵劑來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 異常漢遜酵母Y16(Hansenulaanomala)，分離自甘肅天水傳統(tǒng)釀造漿水，保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室。

乳酸發(fā)酵劑腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)L5，分離自甘肅天水傳統(tǒng)釀造漿水，保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室。

1.1.2保護劑 脫脂奶粉(食品純)購自內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；甘油(分析純)購自上海展云化工有限公司；蔗糖、海藻糖、麥芽糖、吐溫80均為國產(chǎn)分析純，購于天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.1.3培養(yǎng)基 高密度增殖培養(yǎng)基：采用10°Be′麥芽汁培養(yǎng)基。制作方法：大麥芽粉碎，麥芽粉與水的比例為1∶4，38℃保溫2 h，升溫至45℃保持30 min，再升溫至50℃保持30 min，隨后提高到60℃，糖化1～1.5 h至完全糖化，并用雞蛋清煮沸至澄清，稀釋至糖度為9 g/100 mL，再加入葡萄糖11.0 g/L、牛肉膏2.3 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

模擬漿水發(fā)酵培養(yǎng)基：將200 g小芹菜切成條狀，加入1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min，用紗布過濾，獲得芹菜汁，再加入35 g的玉米粉，充分攪勻并過濾，添加蒸餾水至1 000 mL，裝入三角瓶中，用紗布封口后121℃滅菌20 min。

1.1.4主要儀器 SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；THZ-98A恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；FA1004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；YXJ-2離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 真空冷凍干燥工藝流程及技術(shù)參數(shù)

1.2.1工藝流程 菌種增殖培養(yǎng)→離心濃縮→添加保護劑→分裝至培養(yǎng)皿→預(yù)凍→真空冷凍干燥→低溫密閉保存。

1.2.2技術(shù)參數(shù)優(yōu)化 ①酵母菌株Y16高密度增殖培養(yǎng)：參照姚博等[15]高密度增殖培養(yǎng)方法，并做一定的修改。采用10°Be′麥芽汁培養(yǎng)基做增殖培養(yǎng)基，28℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，采用傾注平板法計算發(fā)酵液中的酵母總數(shù)(CFU/mL)，計算結(jié)果重復(fù)3次。

②離心濃縮：使用最佳離心條件，將菌液裝入滅菌后的10 mL離心管，離心后取出上清液，收集菌體，再用0.85%的生理鹽水洗滌3次。

③添加保護劑[16]、預(yù)凍：添加保護劑，并按質(zhì)量比3∶1(w/w)將保護劑與菌泥充分混合后,迅速放入-20℃冰箱中，預(yù)凍12 h。

④真空冷凍干燥：將完成預(yù)凍的培養(yǎng)皿去掉上蓋，迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機中，打開真空泵抽真空，冷阱溫度為-55℃，真空度1 Pa，真空冷凍干燥24 h。

⑤低溫保存：將凍干后的菌劑用封口膜密封，置于4℃保存。

1.2.3凍干菌劑的相關(guān)公式計算 ①離心沉降活細胞率測定：參照GB 4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗、霉菌和酵母的計數(shù)》[17]，將離心后收集的菌體用0.85%的生理鹽水溶解，并梯度稀釋，采用傾注平板法計算活菌數(shù)；同樣，采用傾注平板法計算未經(jīng)離心的原液中的活菌數(shù)，即為初始活菌數(shù)(CFU/mL)。

②凍干菌劑存活率測定：參照GB 4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗、霉菌和酵母的計數(shù)》[17]，取出冷凍干燥完成的菌劑，用0.85%的生理鹽水溶解，40℃水浴30 min使之進行復(fù)水活化并稀釋，再采用傾注平板法測定活菌數(shù)；以離心沉降細胞活菌數(shù)為對照計算凍干菌劑存活率。

1.3 菌體細胞離心收集條件的選擇

Y16菌株經(jīng)高密度增殖培養(yǎng)后，取10 mL菌懸液裝入已滅菌的離心管中，在不同的離心力、時間條件下收集菌體(表1)，同時向離心后的菌泥中加入等體積(10 mL)的生理鹽水溶解，制成菌懸液，然后對菌懸液進行活菌計數(shù)，以未離心的培養(yǎng)液為對照，計算離心沉降活細胞率[18]。

1.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計[19]

選擇脫脂奶粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、甘油、硫酸錳、谷氨酸鈉、吐溫80、維生素C(Vc)9種不同的保護劑，采用Design-Expert 8.0.6設(shè)計次數(shù)為n=12的P-B試驗，考察各因素的主效應(yīng)和交互作用，每個因素分別取高、低2個水平，高水平為低水平的2倍，另外設(shè)有2個虛擬變量(X10/X11)用于估計誤差，具體見表2。

表1 離心條件的篩選Table 1 Screening of centrifugation condition.

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計Table 2 The design of Plackett-Burman experiment.

1.5 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取對活菌保護效果顯著的3個因素(脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖)進行最陡爬坡試驗[20]。

1.6 篩選凍干保護劑復(fù)合配方

根據(jù)最陡爬坡實驗結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6對條件因素進行BBD響應(yīng)面設(shè)計(表3)，以篩選出的凍干菌劑存活率為響應(yīng)值，以期得到最佳的凍干保護劑復(fù)合配方。

1.7 酵母發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性測定

分別取4℃條件下保存1 d、15 d、1個月、2個月、3個月的酵母凍干菌劑，活化后進行活菌計數(shù)，以冷凍干燥后的活菌數(shù)為對照，計算酵母菌的存活率，從而判定酵母直投式增香發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性。

表3 BBD響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 3 The Box-Behnken response surface design of the experiment.

1.8 發(fā)酵劑模擬回接試驗

將10%的酵母Y16直投式增香發(fā)酵劑、10%的乳酸發(fā)酵劑腸膜明串珠菌L5接入裝有50 mL無菌漿水培養(yǎng)液的三角瓶中，進行漿水發(fā)酵，用滅菌后的多層紗布封口，同時設(shè)定對照組，即50 mL無菌漿水液中僅加入10%的乳酸發(fā)酵劑腸膜明串珠菌L5而未添加10%的Y16；在28℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d后，進行感官評定。

1.9 發(fā)酵劑的感官測定[21]

由10位身體健康，且無不良嗜好、偏食和變態(tài)性反應(yīng)的同學(xué)組成評價小組，先對天水孟菇廠傳統(tǒng)釀制的風(fēng)味優(yōu)良的漿水(以10分計)進行感官評價，漱口并在通風(fēng)處保持10 min后，再分別對接種Y16和未接種Y16的漿水進行感官評定，評分標(biāo)準(zhǔn)如表4。

表4 感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Table 4 The marking standard of sensory evaluation.

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株Y16直投式發(fā)酵劑的制備

2.1.1酵母菌株Y16增殖培養(yǎng) 于10°Be′麥芽汁培養(yǎng)基進行高密度增殖培養(yǎng)后，經(jīng)測定，酵母細胞濃度達到9.2×1010CFU/mL。

2.1.2離心條件的選擇 將酵母菌Y16發(fā)酵液按照不同的離心條件進行離心，結(jié)果如表5所示。

由表5可知，離心轉(zhuǎn)速越高、離心時間越長，對細胞的破壞越大，越不利于菌體的收集。當(dāng)離心條件為1 600 g、10 min時，所得的離心沉降活細胞率最高，為95.5%，故后續(xù)研究中采用1 600 g、10 min的離心條件收集菌體。

表5 離心條件篩選結(jié)果Table 5 Screening results of centrifugation condition.

2.1.3篩選最佳凍干保護劑配方P-B試驗結(jié)果

Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果見表6，分析結(jié)果見表7、表8。由表7顯著性排序可知，脫脂奶粉對Y16凍干菌劑存活率影響最為顯著，其次為海藻糖、蔗糖。而表8的顯著性分析結(jié)果進一步表明，該模型篩選凍干保護劑在α=0.01的水平上效果顯著，決定系數(shù)R2=0.988 7，其中，脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖對酵母菌Y16的保護效果極顯著(P<0.01)，故確定這3個因素作為下一步實驗的關(guān)鍵因素。

2.1.4最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果 針對P-B試驗得到的脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖3個最優(yōu)因素，進行最陡爬坡試驗。實驗結(jié)果表明(表9)，11%脫脂奶粉、9%蔗糖、12%海藻糖組合時，保護劑對Y16菌體的保護效果最好，活菌數(shù)目最多，酵母菌Y16的凍干菌劑存活率可達91.54%。

表6 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Corresponding results of Plackett-Burman text design.

注：K、L為虛擬項。

表7 Plackett-Burman試驗因素效應(yīng)分析Table 7 Analyses of the effect of factor in Plackett-Burman design.

注：P<0.01表示差異極顯著；0.010.05表示差異不顯著。

表8 Plackett-Burman試驗因素顯著性分析Table 8 Analyses of the significance of factor in Plackett-Burman design.

注：P<0.01表示差異極顯著；0.010.05表示差異不顯著。

表9 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 9 Screening results of steepest ascent experiment.

2.1.5篩選凍干保護劑BBD響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6對脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖做三因素三水平的BBD響應(yīng)面設(shè)計，以酵母菌Y16真空冷凍干燥過程中的凍干菌劑存活率為響應(yīng)值，結(jié)果見表10。由BBD回歸模型參數(shù)檢驗結(jié)果(表11)可知，該模型篩選出的酵母菌Y16在真空冷凍干燥過程中的復(fù)合保護劑在α=0.01水平上效果顯著，回歸方程失擬項(P=0.442)檢驗不顯著(P>0.05)，表明模型沒有失擬現(xiàn)象；其決定系數(shù)R2=0.984 0，表明僅有1.6%的變異不能由該模型解釋，模型的線性、交互作用影響顯著。經(jīng)二次多項回歸擬合分析，得到以酵母菌Y16的凍干菌劑存活率為響應(yīng)值的回歸方程：Y(存活率/%)=92.62-2.43A+1.08B-3.31C+2.03AB-2.41AC-2.18BC-7.47A2-3.15B2-5.71C2。

表10 響應(yīng)面BBD試驗設(shè)計結(jié)果Table 10 Results of BBD response surface design.

圖1為對脫脂奶粉、蔗糖、海藻糖3個因素的兩兩交互作用做出相應(yīng)的響應(yīng)面圖。由圖A可知，響應(yīng)面曲面坡度陡峭且等高線相對扁而密集，說明添加的脫脂奶粉和蔗糖的交互作用對酵母菌Y16凍干后的存活率具有顯著影響；圖B表明，脫脂奶粉與海藻糖的交互作用對酵母菌Y16凍干菌劑存活率影響極顯著；由圖C可知，響應(yīng)面曲面坡度較平緩，等高線較密集，說明添加的蔗糖與海藻糖的交互作用對酵母菌Y16凍干后的存活率影響較顯著。

2.1.6最優(yōu)冷凍保護劑組合配方確定及驗證

通過對回歸模型進行數(shù)學(xué)分析，得到酵母菌Y16在真空冷凍干燥過程中，添加的最優(yōu)保護劑配方為脫脂奶粉11%、蔗糖9%、海藻糖12%，得到凍干菌劑存活率為93.48%。在此添加量的條件下，重復(fù)試驗3次，得到酵母存活率為91.54%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差為2.17%。說明該模型設(shè)計準(zhǔn)確可靠，得到的最佳保護劑組合方案可行，在實際操作中具有指導(dǎo)意義。

2.1.7酵母發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性測定 由表12可知，經(jīng)上述工藝制備的酵母發(fā)酵劑保存3個月的存活率仍基本保持穩(wěn)定水平，說明該酵母發(fā)酵劑貯藏期間具有較好的穩(wěn)定性，運用于實際生產(chǎn)中具有切實可行性。

2.2 發(fā)酵劑模擬發(fā)酵漿水試驗結(jié)果

將篩選出的Y16制備的酵母直投式增香發(fā)酵劑做模擬發(fā)酵漿水試驗，感官評分結(jié)果如表13。

由表13可知，用Y16制備的酵母直投式增香發(fā)酵劑做模擬發(fā)酵漿水試驗，所得產(chǎn)品感官評分9.1分，且模擬發(fā)酵漿水風(fēng)味優(yōu)良；而未接入Y16的漿水樣品感官評分為7.1，香味與原有漿水相比差別較大，說明篩選出的Y16對漿水發(fā)酵過程中形成的獨特風(fēng)味具有重要作用。

表11 BBD回歸模型參數(shù)顯著性檢驗Table 11 Analysis of significant regression model of BBD.

注：P<0.01表示差異極顯著；0.010.05表示差異不顯著。

圖1 脫脂奶粉(A)、蔗糖(B)、海藻糖(C)3個因素響應(yīng)面圖Fig.1 The graphs of response surface for skim milk powder(A), sucrose(B) and trehalose(C).

儲藏時間凍干菌劑存活率(%)1 d95.3415 d95.281個月94.222個月93.343個月92.00

3 討論

高密度菌液是制備直投式發(fā)酵劑的前提，而如何收集獲得高密度菌體是其關(guān)鍵。在本研究中，Y16經(jīng)高密度增殖培養(yǎng)后細胞濃度可達9.2×1010CFU/mL，再采用離心的方法收集高密度菌體，以期為后續(xù)凍干菌劑的制備奠定基礎(chǔ)。而離心條件的選擇會影響離心沉降活細胞率[22～24]，一方面，由于離心力形成的機械作用以及酸或氧對菌體具有破壞作用；另一方面，離心程度不夠，部分菌體將懸浮于上清液中，從而使離心得率降低。在本實驗中，篩選出的最佳離心條件為1 600 g、10 min，這與任蓓蕾等[25]在生香酵母C42真空冷凍干燥保護劑的篩選和優(yōu)化過程中所采用的離心條件相似，在該條件下，Y16高密度菌體的離心沉降活細胞率為95.5%。

表13 發(fā)酵劑的感官評分結(jié)果Table 13 Results of sensory scores of yeast starters.

注：“()”內(nèi)表示只接種乳酸菌發(fā)酵劑、未接種酵母直投式增香發(fā)酵劑Y16的漿水樣品的感官評分。

在直投式發(fā)酵劑的制備過程中，為避免冷凍干燥對微生物細胞造成損傷，選擇合適的凍干保護劑對于提高細胞凍干菌劑存活率至關(guān)重要[26]。然而，各類保護劑的保護機理有所不同，小分子保護劑可使細胞在冷凍前先部分脫水發(fā)生質(zhì)壁分離，形成緩沖層，從而防止冰晶的產(chǎn)生，對細胞膜起到機械性地保護作用；而脫脂奶粉等大分子保護劑，一方面，通過溶于水，可使菌體和保護劑的混合液呈過冷狀態(tài)，也能在菌體細胞外形成保護膜，另一方面，其可吸附在細胞表面形成黏層，使細胞部分失水，通過增加溶液黏度來抑制冰晶的產(chǎn)生，使細胞周圍的冰晶以不規(guī)則的形狀存在，避免細胞壁遭到破環(huán)[27，28]。邵明倩[29]篩選到布拉氏酵母菌在凍干過程中的最佳保護劑組合為10%脫脂奶粉、12%海藻糖、6%甘油、10%蔗糖，活菌數(shù)達到1.96×1010CFU/g，可見，脫脂奶粉、海藻糖、甘油、蔗糖的保護劑組合對布拉氏酵母菌凍干過程中的保護效果顯著。本研究篩選出對Y16酵母菌株的保護效果最佳的組合為脫脂奶粉、蔗糖和海藻糖，這與喬宏萍等[30]研究紅茶菌的優(yōu)勢酵母菌在凍干過程中最佳保護劑結(jié)果一致，實驗得到的Y16保護劑組合配方為11%脫脂奶粉、9%蔗糖、12%海藻糖，凍干菌劑存活率為91.54%。

食品的感官評定是產(chǎn)品開發(fā)的重要環(huán)節(jié)，對于食品品質(zhì)評價方法來說，嚴(yán)格的感官評定無疑是最具說服力的評價方法[31]。本研究利用Y16增香發(fā)酵劑進行模擬發(fā)酵漿水實驗，其感官評價得分為9.1分，所得模擬發(fā)酵漿水風(fēng)味優(yōu)良，這說明Y16對漿水優(yōu)良的風(fēng)味具有突出貢獻。此外，Y16凍干增香菌劑在4℃保存3個月仍具有較好的貯藏穩(wěn)定性。綜上所述，本研究結(jié)果為漿水直投式增香發(fā)酵劑的開發(fā)提供了良好的種質(zhì)資源。本實驗優(yōu)化了直投式酵母增香發(fā)酵劑的生產(chǎn)工藝，但關(guān)于該發(fā)酵劑的應(yīng)用對發(fā)酵漿水品質(zhì)的改善將是后續(xù)深入研究的重點。