羅 燕

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳 518005）

大環(huán)內(nèi)酯類（MALs）屬中譜抗生素，是一類具有12～22個(gè)碳內(nèi)酯環(huán)的抗生素類群，以1個(gè)大環(huán)內(nèi)酯為母核，通過(guò)糖苷鍵與1～3分子糖相連接，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和支原體具有較強(qiáng)的抗菌活性，臨床上主要用于治療敏感菌引起的呼吸道、消化道和泌尿生殖系統(tǒng)感染，在低劑量下具有良好的促生長(zhǎng)作用[1-2]。MALs產(chǎn)生治療作用的同時(shí)也存在毒副作用，如果殘留超標(biāo)，這些動(dòng)物源性食品流入餐桌后會(huì)對(duì)人體健康造成損害，具有肝、腎毒性[3]。我國(guó)2002年農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)及2005年農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)規(guī)定了紅霉素、替米考星等部分大環(huán)內(nèi)酯類藥物在動(dòng)物組織中的最大殘留限量值，其中紅霉素在動(dòng)物組織中的最大殘留限量（MRL）為 200 μg·kg-1；林可霉素在動(dòng)物組織中MRL為100 μg·kg-1；替米考星在動(dòng)物組織中MRL為100 μg·kg-1。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究都有明顯上升趨勢(shì)，但我國(guó)對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯的殘留檢測(cè)研究較少，因此需要進(jìn)一步加大對(duì)食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留檢測(cè)以保證食品安全[4-5]。目前，MALs殘留檢測(cè)方法主要有微生物法、免疫法（ELISA）、薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[6]。

本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），建立了雞肉中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取新鮮雞胸及雞腿雞肉，充分絞碎，勻質(zhì)，-20℃避光保存。

1.2 儀器設(shè)備

AB Sciex Triple QuadTM 4500質(zhì)譜儀、NEVAP-24型全自動(dòng)氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機(jī)、Milli-Q Integral 3型超純水儀、奧特賽斯AS系列超聲波清洗機(jī)、Oasis PRiME HLB（6cc，200 mg）固相萃取柱。

1.3 主要試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）；乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、螺旋霉素和羅紅霉素均來(lái)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；吉他霉素來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素、羅紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成約1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃保存。

1.5 試驗(yàn)方法

稱取試樣2.5 g，精確到0.01 g，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液（羅紅霉素），置于50 mL離心管中，加乙腈水溶液（80%乙腈水+0.2%甲酸）10 mL，漩渦混勻1 min，超聲5 min，高速冷凍離心機(jī)9 000 r·min-1離心5 min。

移取3.5 mL上清液，直接過(guò)6 cc規(guī)格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持1 s·滴-1的速度，收集濾液。準(zhǔn)確移出2.5 mL濾液至15 mL帶刻度小管內(nèi)，在40℃水浴下氮?dú)獯抵粒?.5 mL。殘留液用甲醇+水+甲酸（10∶90∶0.09）溶液定容至1.00 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.6 儀器條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B相為甲醇溶液；柱溫位40℃；進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓：3.2 kV；源溫：110℃；霧化溫度：350℃；錐孔氣流速：50 L·h-1；霧化氣流速：650 L·h-1。

MALs抗生素質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

空白基質(zhì)及添加藥物樣本。紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素色譜圖見(jiàn)圖1～6。

表2 MALs抗生素質(zhì)譜參數(shù)

圖1 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1紅霉素

圖2 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1替米考星

圖3 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1泰樂(lè)菌素

圖4 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1林可霉素

圖5 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1吉他霉素

圖6 空白基質(zhì)添加15.0 μg·kg-1螺旋霉素

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取5個(gè)陰性樣品經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)方法處理獲得樣品空白提取液。用樣品空白提取液配制混合外標(biāo)濃度為1.00、2.00、5.00、10.0、50.0 μg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素基質(zhì)試驗(yàn)的線性范圍在1.00～50.0 μg·L-1內(nèi)，峰面積與相應(yīng)回收濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為r=0.999 05、r=0.999 67、r=0.999 85、r=0.999 91、r=0.999 02、r=0.999 85。

2.2 方法檢出限確定

以空白雞肉樣本為基質(zhì)，添加濃度為3.00μg·kg-1，按照上述方法全過(guò)程進(jìn)行預(yù)處理和測(cè)定，平行樣本n=6，根據(jù)各樣本檢測(cè)值計(jì)算出平均值X及標(biāo)準(zhǔn)偏差 Sb，再根據(jù)公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（其中：k為置信因子，一般取3），計(jì)算出紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素檢出限分別為0.19、0.90、0.83、0.69、0.84、0.56 μg·kg-1，均低于標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限1.0 μg·kg-1，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 回收率測(cè)定

用空白基質(zhì)樣品進(jìn)行 3.00、6.00、30.0 μg·kg-13個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平取6個(gè)平行樣，按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)樣品回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表3可知，本試驗(yàn)對(duì)雞肉中紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素的提取穩(wěn)定，受到基質(zhì)的干擾較小。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量，通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物（即校正因子）及預(yù)測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算，在一定程度上消除了前處理操作及環(huán)境、儀器條件等的變化所引起的誤差，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。本試驗(yàn)建立的雞肉中紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法通過(guò)回收率和多種食品樣本的實(shí)測(cè)試驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于可食動(dòng)物肌肉紅霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素、林可霉素、吉他霉素和螺旋霉素殘留的檢測(cè)。