陸玉蘭 王 榮 黃華佗 覃海媚 劉純宏 羅宏成 韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科, 百色 533000)

星形膠質(zhì)源性蛋白S100B為S100蛋白家族中的重要成員之一,由α和β兩種亞基組成,分子量為21kD[1]。S100B廣泛分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、皮膚朗格漢斯細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群、肌衛(wèi)星細(xì)胞等[2]。S100B是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì),如參與細(xì)胞的增殖與分化,調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡,參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)節(jié)鈣離子的平衡等。此外,S100B蛋白可通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合后激活轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)及p38MAPK 等信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥因子的活性,從而導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的應(yīng)激與凋亡[3-4]。既往研究表明,S100B蛋白在缺血性腦卒中、黑色素瘤、創(chuàng)傷性腦損傷和自閉癥等疾病中扮演重要的角色[5-8]。然而,人們對(duì)S100B的研究主要集中在血清水平,關(guān)于S100B基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性的研究還比較少。本研究通過分析S100B基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西百色地區(qū)人群中的分布,并與Hap Map數(shù)據(jù)庫公布的4個(gè)人群S100B基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,探討S100B基因多態(tài)性在不同地區(qū)種族人群中的分布差異,為深入研究S100B基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供重要的遺傳學(xué)理論依據(jù)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2016年3～10月到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的體檢者398例,其中男性231 例,女性167例,平均年齡(58.09±8.76)歲。所有研究對(duì)象均來自廣西地區(qū),且相互無血緣關(guān)系。排除腫瘤、心腦血管疾病及感染性疾病等。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

1.2 基因組DNA提取

采集體檢者靜脈血3ml,用含有EDTA-K2抗凝劑的采血管保存。采用離心柱法進(jìn)行基因組DNA提取,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

引物用在線Primer3 軟件設(shè)計(jì)(http： //bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/),并由上海天昊生物科技有限公司合成。其中rs2839356位點(diǎn)的上游引物序列為： 5′-TCACCTTCAGGGCAGCTGAGAA-3′,下游引物序列為： 5′-TGGAAGGGAGGGAGACAAGCAC-3′;擴(kuò)增片段長度為175bp,延伸引物為： 5′-TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAAAGCCAGTGT ACAGATGGAT-3′;rs881827上游引物序列為： 5′-TGTGTGTGGAAGTCCCTGTCTCA-3′;下游引物序列為： 5′-CCCTGCACTGTGGTTGTTCCTC-3′;擴(kuò)增片段長度為248bp,延伸引物為： 5′-TTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGCTGAAGTAACT CTTGGGAAC-3′。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用20μl反應(yīng)體系,其中包括1×GC-I 緩沖液(TaKaRa)、1μl 多重PCR引物、1 U HotStarTaq 聚合酶(Qiagen Inc.)、3.0mmol/L鎂離子、0.3mmol/L dNTP、1μl DNA模板,余下體積用經(jīng)過嚴(yán)格高壓滅菌的雙蒸水補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)參數(shù)為： 95℃預(yù)變性2min;擴(kuò)增階段為： 94℃預(yù)變性20s,65℃退火40s,72℃延伸1.5min,循環(huán)11次;94℃預(yù)變性20s,59℃退火30s,72℃延伸1.5min,循環(huán)24次;最后階段72℃延長2min。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得,PCR產(chǎn)物經(jīng)過蝦堿酶(SAP， Promega公司)和外切酶I(EXO I， Epicentre公司)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用SAP純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩位點(diǎn)基因型及等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算;兩組間基因型及等位基因頻率的比較均采用χ2檢驗(yàn);采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)評(píng)估樣本的群體代表性。

2 結(jié)果

2.1 S100B的基因型檢測

S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),兩位點(diǎn)基因型均達(dá)Hardy-Weinberg平衡(P值分別0.202和0.902),表明本研究具有群體代表性。測序結(jié)果顯示,rs2839356和rs881827兩位點(diǎn)都包含TT、CT、CC 3種基因型,DNA測序法證實(shí)了該結(jié)果(圖1A、B)。

圖1 S100B基因rs2839356和rs881827測序圖

2.2 S100B基因rs2839356和rs881827多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布

統(tǒng)計(jì)分析表明,廣西百色地區(qū)人群中,S100B基因rs2839356、rs881827兩位點(diǎn)分別以TT和CT基因型多見,其頻率分別為49.2%和48.3%,以T和C等位基因分布頻率最高,各占71.1%和58.5%。兩位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率在男、女兩組間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示這兩個(gè)位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率在廣西百色地區(qū)人群中分布與性別無關(guān)(表1)。

2.3 S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)多態(tài)性在不同地區(qū)種族人群間的比較

廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計(jì)劃(htt： //www.Hapmap.org)公布的Hap Map-CEU (Utah residents with Northern and Western European ancestry)、Hap Map-YRI (Japanese in Tokyo)和Hap Map-CHB (Han Chinese in Beijing, China)3個(gè)人群SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,廣西百色地區(qū)人群rs2839356、rs881827兩位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布與Hap Map-CEU、Hap Map-YRI和Hap Map-JPT相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Hap Map-CHB相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2、3)。

表1 S100B 基因rs2839356和rs881827多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布(%)

Genotype and allele frequencies of S100B gene showed no significant difference among the same group of male and female (P>0.05)

表2 廣西百色地區(qū)人群rs2839356位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計(jì)劃掃描所得的其他地區(qū)種族人群的結(jié)果比較(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

表3 廣西百色地區(qū)人群rs881827位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計(jì)劃掃描所得的其他地區(qū)種族人群的結(jié)果比較(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

3 討論

3.1 研究S100B基因多態(tài)性的重要性

流行病學(xué)研究表明,遺傳背景的差異可以造成不同種族人群對(duì)于某些疾病存在不同的易感性,通過研究不同地區(qū)人群基因多態(tài)性,不僅有助于認(rèn)識(shí)不同種族人群對(duì)某一疾病易感性的差異,而且對(duì)于研究某些疾病的發(fā)病機(jī)制及基因水平的診斷和治療有重要意義。因此,S100B基因多態(tài)性的研究是解釋相關(guān)疾病臨床表現(xiàn)多樣化的一個(gè)有用的方法,在對(duì)一些疾病S100B基因的多態(tài)性進(jìn)行研究時(shí),首先了解其在正常人群中的分布特點(diǎn),是正確分析基因多態(tài)性與相關(guān)疾病之間關(guān)系的前提。

人類S100B的基因位于21號(hào)染色體長臂(21q22.3),由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,其mRNA長度為1095bp,編碼91個(gè)氨基酸。S100B 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜,當(dāng)轉(zhuǎn)錄被抑制,需要依賴特異性反向因子才能啟動(dòng)它的表達(dá)[9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)編碼S100B基因序列中存在SNP位點(diǎn),而這些多態(tài)性位點(diǎn)可能參與了相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。既往研究表明,S100B基因多態(tài)性與閱讀障礙癥、精神分裂癥、自閉癥、抑郁癥和手足口病等疾病密切相關(guān)[10-14]。SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的改變,它是人類可遺傳變異中最常見的類型,也是個(gè)體或者群體之間遺傳差異最主要的表現(xiàn)形式。SNP的研究有助于解釋不同群體和個(gè)體對(duì)疾病,特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性以及對(duì)各種藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因素反應(yīng)的表型差異。現(xiàn)有研究表明,具有不同遺傳背景的人群,對(duì)疾病也存在不同的易感性。芬蘭學(xué)者M(jìn)atsson等[10]研究表明S100B基因rs9722 T等位基因與閱讀障礙癥的發(fā)生存在相關(guān)性,而我國學(xué)者羅秀等[15]報(bào)道S100B基因rs9722的遺傳變異與閱讀障礙癥相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,出現(xiàn)此差異的原因之一可能是兩種研究人群的遺傳背景不一樣。因此,了解S100B 基因多態(tài)性及其分布特點(diǎn),可提供不同地區(qū)人群的遺傳背景資料,為進(jìn)一步研究相關(guān)疾病在不同地區(qū)人群中的發(fā)病情況提供遺傳信息,同時(shí),對(duì)認(rèn)識(shí) S100B相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和防治措施有重要的指導(dǎo)意義。

3.2 S100B基因多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布及其與不同地區(qū)人群的比較

本研究采用單堿基延伸技術(shù)和DNA 測序法檢測廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)的多態(tài)性,并與Hap Map數(shù)據(jù)庫上公布的4種人群的SNP分型數(shù)據(jù)比較,結(jié)果顯示,廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356、rs881827位點(diǎn)在不同性別間基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明兩位點(diǎn)多態(tài)性與性別無關(guān)。與Hap Map上公布的4種不同地區(qū)種族人群SNP分型數(shù)據(jù)比較后表明,廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356、rs881827位點(diǎn)多態(tài)性與親緣關(guān)系最近的中國北京漢族人(Hap Map-CHB)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的歐洲人(Hap Map-CEU)、非洲人(Hap Map-YRI)、日本人(Hap Map-JPT)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果符合“親緣關(guān)系越近,其基因型分布越相似,親緣關(guān)系越遠(yuǎn),差異越顯著”的遺傳學(xué)規(guī)律,同時(shí),也提示S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)多態(tài)性與其他地區(qū)種族人群相比存在差異。基因多態(tài)性可能因地理位置、環(huán)境、飲食和生活習(xí)慣以及種族不同而呈現(xiàn)不同程度的差異[16],而廣西是一個(gè)多民族聚集的地區(qū),地理環(huán)境獨(dú)特,生活方式與其他地區(qū)也存在較大的差異,也可能會(huì)導(dǎo)致基因多態(tài)性分布的差異,因此,雖然Hap Map-HCB、Hap Map-JPT人群和廣西百色地區(qū)人群同屬于亞洲人群,但這3個(gè)不同地區(qū)人群的基因型和等位基因分布頻率也表現(xiàn)出一定差異。

總之,本研究初步探討了S100B基因rs2839356和rs881827位點(diǎn)多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布特征,并分析其與不同地區(qū)種族人群的分布差異,為進(jìn)一步研究群體遺傳學(xué)和預(yù)防相關(guān)疾病奠定了重要基礎(chǔ)。雖然本研究表明廣西百色地區(qū)人群S100B基因存在多態(tài)性,且與其他地區(qū)種族人群相比存在差異,但是,本研究仍存局限性,首先,研究的樣本量相對(duì)較小。其次,廣西是一個(gè)多民族聚集的地區(qū),各民族間是否有差異,需要我們進(jìn)一步研究。而且,本研究所選的人群是醫(yī)院的體檢者,可能存在選擇人群的偏倚。因此,如何深入研究S100B基因在不同人群中存在多態(tài)性的機(jī)制,是本課題組今后努力的方向。