馬 朋 曹 璋 張瑾錦 曹同濤△

(濱州醫(yī)學(xué)院, 1 藥學(xué)院, 2 基礎(chǔ)學(xué)院, 3 醫(yī)藥研究中心, 煙臺 264003)

異甘草素(isoliquiritigenin, ISL)(2′,4,4′-三羥基查爾酮)是一種具有查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物,是甘草及多種植物中的活性成分之一。異甘草素目前已經(jīng)被證明具有廣泛的生物學(xué)活性,尤其在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗自由基、松弛血管等方面都具有較好的效果[1-3],但有關(guān)異甘草素抗肝癌作用的報(bào)道較少。本研究以異甘草素為實(shí)驗(yàn)藥物,初步探討異甘草素對人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

異甘草素購于大連美侖生物技術(shù)公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為HyClone公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品;Cell Counting Kit (CCK8)試劑盒和Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡測試試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 人肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

人肝癌HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,以含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)消化傳代。取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,胰酶消化后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度按1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后,分成空白對照組、溶劑對照組和6個(gè)不同濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓φ战M只加入DMEM培養(yǎng)液;溶劑對照組加入含0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)液;6個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入先用二甲基亞砜(DMSO)溶解、再經(jīng)DMEM培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg/L的異甘草素(含DMSO≤0.1%[4])。每組設(shè)6個(gè)平行孔。

1.3 CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況

異甘草素作用HepG2細(xì)胞24h和48h后,各孔中加入10μl的CCK8溶液,培養(yǎng)箱中孵育2h,用TECAN M200酶標(biāo)儀測定450nm處的光密度OD值[5]。空白孔調(diào)零,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%

1.4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

40mg/L異甘草素處理人肝癌HepG2細(xì)胞24h后,收集所有細(xì)胞,加入2.5%的戊二醛固定液4℃ 1500r/min 離心5min,棄去上清液。PBS洗1次,1500r/min 離心5min。取一潔凈的EP管,用微量移液器注入10～20μl血清,取離心后的細(xì)胞團(tuán)塊放入EP管中,注入2.5%的戊二醛固定液,2000r/min離心5min,棄上清,把細(xì)胞團(tuán)塊小心挑起,移入已加固定液的青霉素小瓶中,送專業(yè)實(shí)驗(yàn)室制備透射電鏡樣品,JEM1400透射電子顯微鏡觀察并照像。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

以5、10、20、40mg/L的異甘草素作用HepG2細(xì)胞24h和48h后,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞移至離心管中,2000r/min離心5min后收集細(xì)胞。用PBS緩沖液洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml,采用南京凱基生物科技公司的Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,按試劑盒提供的方法進(jìn)行AnnexinⅤ-PI染色,經(jīng)FACscan流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的異甘草素(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg/L)作用HepG2細(xì)胞24h和48h后,對細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用,細(xì)胞的增殖抑制率呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性(表1)。與相應(yīng)空白對照組比較,不同濃度異甘草素的增殖抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度異甘草素對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制率±s, %)

*P<0.05vs0mg/L

2.2 電鏡觀察HepG2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

正常培養(yǎng)的對照組肝癌HepG2細(xì)胞透射電鏡下可見細(xì)胞邊緣界限清晰,細(xì)胞核為正常形態(tài)(圖1A)。40mg/L異甘草素作用HepG2細(xì)胞24h后,觀察到細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集,斷裂分解為大小不等的球形結(jié)構(gòu),出現(xiàn)凋亡小體(圖1B),呈明顯的細(xì)胞形態(tài)改變。

圖1 異甘草素作用HepG2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),標(biāo)尺=2μm

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

采用AnnexinⅤ和PI雙染分析細(xì)胞凋亡率,可以將正常細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞、凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開[6-7]?？瞻讓φ战M細(xì)胞中凋亡細(xì)胞含量較低,而不同濃度異甘草素作用24、48h后,凋亡細(xì)胞百分率逐漸增高,與相應(yīng)時(shí)間的空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,存在明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性(表2)。

表2 異甘草素作用后HepG2細(xì)胞的凋亡率±s, %)

*P<0.05vs0mg/L

3 討論

肝癌是威脅人類生命健康的嚴(yán)重疾病之一,也是眾多發(fā)展中國家的常見疾病,發(fā)病率高達(dá)80%[8-9]。肝癌具有發(fā)病隱藏,初期癥狀不典型,惡性程度高,死亡率和發(fā)病率都極高的特點(diǎn)。因此,尋找高效的抗肝癌藥物一直是抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

異甘草素是一種異黃酮類化合物,主要存在于甘草及其他多種植物的根部。異甘草素具有廣泛的藥理活性,在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、擴(kuò)張動(dòng)脈、保護(hù)心和腦等方面具有較好的生物學(xué)活性。近年來研究表明,異甘草素對多種腫瘤具有明顯的抑制作用[10-11],但有關(guān)異甘草素抗肝癌作用的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究異甘草素對人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)CCK8法檢測結(jié)果顯示異甘草素對人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用,并呈良好的濃度和時(shí)間依賴性。通過透射電鏡觀察到,異甘草素作用后人肝癌HepG2細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變,具有細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集,斷裂分解為大小不等的球形結(jié)構(gòu),出現(xiàn)凋亡小體等現(xiàn)象。用AnnexinⅤ和PI雙染流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示異甘草素可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡,不同濃度異甘草素作用24h和48h后,細(xì)胞凋亡率顯著增加。

以上研究結(jié)果表明,異甘草素可引起人肝癌HepG2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改變,并能引起HepG2細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮其對人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。但其具體的分子作用機(jī)制還不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。