楊夏， 孫從永， 余江南， 徐希明

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

多糖作為一種天然活性生物大分子，來源廣泛、安全性高且具有良好的調(diào)脂和降脂活性，如目前研究最多的褐藻藻酸雙酯鈉、杏鮑菇多糖和硫酸軟骨素等[1-3]。玉米須多糖是一種富含糖醛酸的雜聚糖，基本無毒副作用，具有顯著的降血糖和調(diào)脂活性[4-5]。玉米須多糖中存在大量的玉米須酸性多糖(acid corn silk polysaccharide，ACSP)純化組分，然而關(guān)于ACSP的相關(guān)結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)血脂活性的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以簡(jiǎn)便可行的大孔陰離子交換樹脂和凝膠柱純化法從玉米須多糖中分離純化ACSP組分，考察其基本結(jié)構(gòu)特征，并利用高脂飼料致高血脂小鼠模型考察ACSP對(duì)體內(nèi)血脂的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

干燥玉米須購于鎮(zhèn)江同仁堂藥店；D315大孔樹脂(天津市津達(dá)正通環(huán)?？萍加邢薰?；葡聚糖凝膠柱Sephadex G100(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海Sigma公司)；剛果紅(國藥集團(tuán))；光譜級(jí)溴化鉀(國藥集團(tuán))；雄性ICR小鼠(清潔級(jí))，體質(zhì)量(20±2)g，購自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(Su) 2013- 0011，于室溫(23±2)℃下飼養(yǎng)；血漿膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

ALC-110.4型電子天平(德國Sartorius公司)；UV-2600(日本島津公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；冷凍干燥機(jī)(德國Christ)；紅外光譜儀(Thermal Fisher Scientific公司)；酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 ACSP的分離純化

玉米須粗多糖的提取按照文獻(xiàn)[6-7]，采用水提醇沉，三氯乙酸法除蛋白。粗多糖20 g經(jīng)D315大孔陰離子交換樹脂分離，控制層析柱流速為1 mL·min-1，依次用一定體積的純化水及0.1、0.3、0.5 mol·L-1NaCl溶液洗脫，每10 mL收集1管。苯酚硫酸法[8]檢測(cè)洗脫液中的多糖含量，以對(duì)應(yīng)光密度D值作為縱坐標(biāo)，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，合并相同組分洗脫液，濃縮、透析(3.5 kD)后凍干，得到不同玉米須多糖組分。收集由0.3 mol·L-1NaCl溶液洗脫得到的多糖組分5.642 3 g，進(jìn)一步經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G100層析柱純化，控制層析柱流速為1 mL·min-1，以純化水洗脫，5 mL收集1管，同上操作，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，合并單一洗脫峰的洗脫液，濃縮、透析(14 kD)后凍干，即得ACSP。

1.3 ACSP結(jié)構(gòu)研究

1.3.1 糖含量測(cè)定 中性糖的含量用苯酚硫酸法測(cè)定，酸性糖含量用硫酸咔唑法[9]測(cè)定。

1.3.2 高效凝膠色譜法測(cè)分子量 分析儀器及參數(shù)：Agilent 1260-ELSD 檢測(cè)器(蒸發(fā)溫度30 ℃，漂移管溫度30 ℃，氮?dú)饬魉?.59 L·min-1)；流動(dòng)相：20 mmol·L-1乙酸銨水溶液(0.6 mL·min-1)；色譜柱：TSK-凝膠柱G4000PW(7.5 mm×300 mm)，TSK-保護(hù)柱PWH(7.5 mm×75 mm)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別精密稱取不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(670，270，80，25，5 kD)10 mg配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，20 μL進(jìn)樣。以不同標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量的自然對(duì)數(shù)(lnMw)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

玉米須多糖樣品分子量測(cè)定：精密稱取ACSP，配制成1 mg·mL-1的水溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)樣分析，記錄出峰時(shí)間，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖的分子量。

1.3.3 紅外光譜測(cè)定 傅里葉變換紅外光譜儀參數(shù)：溫度為30 ℃，掃描次數(shù)32，分辨率16 cm-1；取適量干燥的ACSP，與干燥的溴化鉀粉末研磨混合，壓片，上機(jī)測(cè)定。記錄4 000 cm-1～ 400 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜圖。

1.3.4 柱前PMP衍生化法測(cè)定單糖組成[10-11]儀器及參數(shù)：Agilent 1260-DAD 檢測(cè)器(λ=254 nm)；流動(dòng)相：A(0.1% 甲酸-50 mmol·L-1乙酸銨溶液)，B(0.1% 甲酸水溶液)，C(乙腈)，1 mL·min-1；梯度方法：0～6 min，A(80%)，C(20%)；6～6.5 min，B(80%)，C(20%)，6.5～20min，B(80%)，C(20%)；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品：1 mg·mL-1的D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-巖藻糖8種標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照品溶液和作為內(nèi)標(biāo)的乳糖標(biāo)準(zhǔn)液；各單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)液并加入終濃度為5 mg·mL-1的乳糖內(nèi)標(biāo)；30 mg ACSP樣品水解后加入乳糖內(nèi)標(biāo)；各樣品按文獻(xiàn)方法衍生化后取20 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)各單糖峰面積計(jì)算單糖之間的比例。

1.3.5 剛果紅試驗(yàn)測(cè)定多糖鏈構(gòu)象[12]稱取5 mg ACSP溶于2 mL去離子水，加入等體積剛果紅試劑(910 μmol·L-1)，充分混勻，以純化水作為空白，在紫外分光光度計(jì)進(jìn)行300～ 700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。在各樣品溶液中逐步加入NaOH水溶液(1 mol·L-1)，使溶液中NaOH濃度依次為0.05，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4 mol·L-1，記錄不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長(zhǎng)。以NaOH濃度(C)為橫坐標(biāo)，最大吸收波長(zhǎng)(λmax)為縱坐標(biāo)，繪制折線圖。

1.4 ACSP降血脂活性研究

1.4.1 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)均分為6組(n=7)，即空白對(duì)照組、模型組、500 mg·kg-1ACSP高劑量組(ACSP-500)、100 mg·kg-1ACSP低劑量組(ASCP-100)、陽性藥洛伐他汀組和陽性藥脂必妥組。

1.4.2 高脂飼料誘導(dǎo)高血脂小鼠模型的建立[13]空白對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)維持型飼料，其余各組均飼喂高脂飼料[配方組成(%)：黃豆15，麩皮12，小麥粉11，玉米粉15，魚粉2、骨粉2、鹽0.7，復(fù)合多維0.3、豬油15，油花生8，麻油3，雞蛋2，奶粉2，蔗糖12]；ACSP組每日分別以相應(yīng)劑量的ACSP灌胃，陽性組分別灌胃與ACSP低劑量組相同且等體積的洛伐他汀(100 mg·kg-1)和中成藥脂必妥(100 mg·kg-1)。

1.4.3 血樣采集與測(cè)定 給藥30 d后，各組小鼠禁食24 h不禁水，眼球取血置于肝素管中。3 500 r·min-1離心10 min，取上層血漿，-20 ℃保存待用；按總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測(cè)各樣品的4項(xiàng)指標(biāo)，并根據(jù)下式計(jì)算反映心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)：Kch=(TG/5+LDL-C)/HDL-C；

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 ACSP的分離純化

20玉米須粗多糖經(jīng)分離純化，得到組分ACSP 4.335 4 g，收率約為21.68%。

如圖1所示，由D315洗脫曲線可知，0.3 mol·L-1NaCl溶液洗脫組分ACSP含量最高；由凝膠柱洗脫曲線可知ACSP峰形較窄且對(duì)稱，表明其分子量分布范圍窄，純度較高。

圖1 ACSP的洗脫曲線

2.2 ACSP的結(jié)構(gòu)

2.2.1 糖含量 測(cè)得ACSP中中性糖和糖醛酸含量分別為(55.83±2.98)%和(37.00±1.03)%，酸性糖含量高，且中性糖和酸性糖總含量超過90%，表明ACSP純度較高。

2.2.2 分子量 高效凝膠色譜圖如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的自然對(duì)數(shù)與其保留時(shí)間符合以下關(guān)系式：lnMw=-0.803 5t+25.441，R2=0.994 6；將ACSP保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到ACSP的分子量為19.32 kD。

圖2 ACSP分子量高效凝膠色譜圖

2.2.3 紅外光譜 如圖3所示，ACSP表現(xiàn)多糖特征性的共振吸收峰。3 434 cm-1處較寬吸收峰是多糖典型的紅外光譜吸收峰，來源于多糖結(jié)構(gòu)中大量存在的O-H鍵伸縮振動(dòng)吸收；其次，2 927 cm-1處歸屬于C-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，1 400～1 600 cm-1附近的吸收峰歸屬于C=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1 637 cm-1和1 508 cm-1是由羧基結(jié)構(gòu)中的C=O 和C-O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。

圖3 ACSP紅外測(cè)定圖譜

2.3.4 單糖組成 由圖4可知，各單糖之間分離程度較好。 ACSP由7種單糖組成，分別為D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸，摩爾比為1.00 ∶0.20 ∶0.91 ∶1.85 ∶0.60 ∶0.24 ∶2.00，其中葡萄糖醛酸含量最高，此結(jié)果與ACSP的糖含量測(cè)定結(jié)果及紅外圖譜分析結(jié)果一致。

2.3.5 ACSP鏈構(gòu)象 由圖5可知，與剛果紅對(duì)照液相比，ACSP+剛果紅混合液的最大吸收波長(zhǎng)未出現(xiàn)紅移現(xiàn)象。

1：D-甘露糖；2：L-鼠李糖；3：D-葡萄糖醛酸；4：乳糖(內(nèi)標(biāo))；5：D-葡萄糖；6：D-半乳糖；7：L-阿拉伯糖；8：D-木糖；9：L-巖藻糖

圖4ACSP單糖組成測(cè)定圖譜

圖5 ACSP剛果紅測(cè)定結(jié)果

2.3 ACSP的降血脂活性

如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組血漿總膽固醇(t=4.42)、三酰甘油(t=4.02)和LDL-C(t=3.48)水平均顯著增高(P<0.05)，而HDL-C水平明顯降低(t=3.15，P<0.05)，表明高血脂模型建立成功。與模型組相比，100 mg·kg-1ACSP組血漿總膽固醇(t=2.20)、三酰甘油(t=2.93)和Kch值(t=2.31)均明顯降低(P<0.05)，LDL-C和HDL-C水平無變化。Kch值越小代表發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)越小，說明在此模型中，低劑量ACSP顯示一定的降血脂活性；當(dāng)ACSP劑量為500 mg·kg-1時(shí)，血漿總膽固醇(t=4.18)、三酰甘油(t=3.53)、LDL-C(t=3.54)和Kch(t=3.24)較模型組顯著降低(P<0.05)，且降低至對(duì)照組小鼠水平；此外，ACSP給藥組對(duì)模型小鼠的HDL-C水平無明顯改善作用；脂必妥陽性組結(jié)果與ACSP組基本相同。

組別總膽固醇(mmol·L-1)三酰甘油(mmol·L-1)LDL-C(mmol·L-1)HDL-C(mmol·L-1)Kch對(duì)照組3.15±0.451.23±0.170.77±0.135.49±0.470.23±0.04模型組4.69±0.56a1.87±0.39a1.47±0.62a4.54±0.45a0.34±0.08aACSP-100組3.85±0.68b1.40±0.12b1.77±0.334.90±0.600.26±0.04bACSP-500組3.18±0.62b1.28±0.29b0.76±0.15b4.69±0.510.22±0.06b洛伐他丁組3.30±0.49b1.41±0.29b0.74±0.15b5.28±0.86b0.21±0.03b脂必妥組3.58±0.78b1.28±0.22b0.74±0.18b5.03±0.300.20±0.05bF值5.594.6211.862.853.71P值0.0010.0030.0000.0280.011

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討論

臨床上常用的他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑和膽汁酸螯合劑類等降血脂藥物，分別從減少內(nèi)源性脂質(zhì)合成、加快體內(nèi)脂質(zhì)代謝和抑制外源性脂質(zhì)吸收三個(gè)方面調(diào)節(jié)血脂水平；但是均存在一定的不良反應(yīng)，如樹脂類膽汁酸螯合劑不溶于水，可能導(dǎo)致惡心腹脹；貝特類和他汀類藥物可能導(dǎo)致高尿酸血癥、神經(jīng)損傷、肌肉損傷和皮膚病等[14]。玉米須安全性很高，Wistar大鼠飼喂玉米須90 d未見任何毒性反應(yīng)[15]。玉米須粗多糖經(jīng)超濾離心后得到的多糖組分PCS2，對(duì)高脂飲食和鏈佐星造模的高血糖模型小鼠具有一定的降血脂活性[4]。但是，其未依據(jù)玉米須多糖組分的性質(zhì)不同進(jìn)行分離純化，對(duì)于其純化組分的結(jié)構(gòu)研究仍有欠缺。

本實(shí)驗(yàn)利用大孔陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠柱分離純化玉米須多糖，得到含量最高的酸性多糖純化組分ACSP。ACSP在大孔陰離子交換樹脂上會(huì)有保留，因此可用一定濃度的NaCl溶液洗脫純化。此方法重復(fù)性高、耗費(fèi)低且同一純化組分性質(zhì)一致。結(jié)構(gòu)研究表明，ACSP是由7種單糖組成的雜聚糖，其糖醛酸含量為(37.00±1.03)%，分子量為19.32 kD，紅外光譜中1 400～1 600 cm-1處的吸收峰提示在ACSP中存在大量的糖醛酸[16]，840 cm-1處的吸收峰提示ACSP的糖苷鍵為α-構(gòu)型，此結(jié)果與文獻(xiàn)[17-18]等結(jié)果一致。剛果紅試驗(yàn)中，ACSP與剛果紅的絡(luò)合物未發(fā)生明顯紅移現(xiàn)象，此結(jié)果與其他非三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖相同[19-20]，證明ACSP不是三螺旋結(jié)構(gòu)，此結(jié)果也驗(yàn)證了關(guān)于雜多糖不能形成三螺旋結(jié)構(gòu)的假說[21]。

糖醛酸是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的單糖，即結(jié)構(gòu)中的伯羥基可氧化成為羧基，從而使多糖表現(xiàn)出特殊的性質(zhì)。糖醛酸含量對(duì)多糖脂質(zhì)結(jié)合能力有影響，Pau-Roblot等[22]研究發(fā)現(xiàn)主要由糖醛酸組成的同聚半乳糖醛酸果膠類物質(zhì)可以吸附脂質(zhì)分子，如膽固醇和亞麻酸等，其中，糖醛酸的含量、種類、構(gòu)型均可影響其與脂質(zhì)分子的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，高劑量ACSP組血漿總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和Kch值均顯著降低，表明ACSP對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的高血脂模型小鼠表現(xiàn)出明顯的降血脂活性。然而ACSP中糖醛酸含量與其降血脂活性大小之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步考察。由于目前儀器分析水平的限制，大量活性顯著的多糖未能得到深入研究，多糖重復(fù)單元的確認(rèn)、理化性質(zhì)的考察、體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)的研究仍亟待解決。