錢洲楠， 張金虎， 王誠悅， 周洋， 焦志敏， 何宜晨， 殷喜豐， 孫浩， 陳兵海

(江蘇大學附屬醫(yī)院泌尿外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

腎細胞癌是泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中較為常見的一種，在成人惡性腫瘤中所占比例較高，而且我國的腎癌發(fā)病率正逐年遞增[1-3]。腎癌的病因尚未明確[4]，且起病隱匿，無臨床癥狀，多由健康體檢時發(fā)現(xiàn)[5]，而這些患者占腎癌患者總數(shù)的50%甚至60%以上。近30%的腎癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生癌細胞的轉(zhuǎn)移[6-7]，目前治療腎癌最主要的方法仍然是腎臟的根治性手術(shù)切除。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腎癌患者經(jīng)各種方法治療后的5年生存率分別為92%、86%、64%、23%[8]，但即便經(jīng)外科根治術(shù)治療后，仍有部分患者有發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，可見腎癌的早期診斷意義重大[9]。因此，探討腎癌發(fā)病的分子機制并發(fā)掘可用于腎癌早期診斷、治療及預后評估的分子靶標成為當務之急。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)功能強大，在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及蛋白質(zhì)代謝等各個水平均具有不可替代的作用[10-11]，因而影響著多種生物學過程。其機制主要涉及對基因表達水平的調(diào)控，并且于正常細胞和惡性腫瘤細胞中存在差異表達。目前已知有大量LncRNA參與惡性腫瘤的發(fā)生、演變和進展，有的LncRNA表達可以促進癌變，有的LncRNA表達則可以抑制癌變[12-13]。

cBioPortal for Cancer Genomics(cBioPortal，http：∥www.cbioportal.org)是一個惡性腫瘤相關(guān)基因組數(shù)據(jù)探索、可視化及分析的平臺，有助于在惡性腫瘤組織以及細胞學的相關(guān)研究中獲得分子學相關(guān)數(shù)據(jù)以及理解遺傳、表觀遺傳、基因表達和蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)[14]。我們通過cBio Cancer Genomics Portal分析了LncRNA PIK3CD-AS1的臨床特征，發(fā)現(xiàn)其與腎癌的分期和轉(zhuǎn)移可能有關(guān)，但其確切的功能和分子機制尚未明確。

本研究通過熒光定量PCR、細胞轉(zhuǎn)染、細胞增殖及凋亡實驗、基因表達譜芯片等方法來探討PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達狀況及其對腎癌細胞增殖和凋亡的影響，并尋找可能存在的與其相互作用的關(guān)聯(lián)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株(HK-2、769-P、786-O、A498)由江蘇大學附屬醫(yī)院中心實驗室保存；1640培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清(南京福麥斯生物有限公司)；RNA抽提試劑盒(上海超研生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京昂杰斯生物科技有限公司)；SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；PCR前后引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PIK3CD-AS1過表達載體及G418藥物(上海北諾生物科技有限公司)；CCK-8增殖實驗試劑盒(翊圣生物科技公司)；凋亡試劑盒(南京福麥斯生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及qRT-PCR檢測PIK3CD-AS1 復蘇正常腎小管上皮細胞HK-2和腎癌細胞769-P、786-O和A498。4種細胞用含有10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到90%時，將4種細胞進行消化，采用RNA抽提試劑盒，提取總RNA，對總RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量行純度分析，使D(280 nm)/D(260 nm)比值為1.8～2.1。按反轉(zhuǎn)錄說明書在20 μL體系中加入2 μg總RNA，反應條件為 37℃ 15 min，85 ℃ 5 s生成cDNA，稀釋10倍體積。隨后進行qRT-PCR，以cDNA為模板，按20 μL體系加入相應試劑進行擴增，每個待測樣本設置3～6個重復樣本，加入PIK3CD-AS1前后引物(上游：5′-AGCAGTAAACCTTCCCCTCC-3′；下游：5′-TCTTGAACCCCACCAGACTC-3′)進行qRT-PCR，以GAPDH作為內(nèi)參。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算各組細胞PIK3CD-AS1/GAPDH比值。實驗重復3次。

1.2.2 過表達載體的轉(zhuǎn)染及過表達細胞的篩選 選取PIK3CD-AS1表達最低的且處于對數(shù)生長期的769-P細胞，經(jīng)細胞計數(shù)，按1.5×105個/孔密度接種于12孔板上，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后待細胞匯合度達到80%～90%，按照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將PEGFP-N1-PIK3CD-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入769-P細胞，作為實驗組。同時以PEGFP-N1質(zhì)粒作為陰性對照組，以未轉(zhuǎn)染的769-P作為空白對照組。轉(zhuǎn)染24 h后，細胞以1 ∶10比例傳代至另一塊12孔板，待其均貼壁展開后加入終濃度為300 μg/mL的G418進行細胞株的篩選。2周后挑取單個陽性克隆細胞并接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)7～8 d，使用熒光顯微鏡逐一觀察熒光，有綠色熒光蛋白表達的為陽性克隆細胞。將陽性克隆細胞傳入12孔板進行培養(yǎng)，待其長滿后重復篩選挑取克隆3次，逐漸依次傳入24孔板、12孔板、6孔板，最后傳入大培養(yǎng)皿中擴大培養(yǎng)。經(jīng)G418多次篩選后，提取各組細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，進行qRT-PCR，所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法計算各組細胞PIK3CD-AS1/GAPDH比值，實驗重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測過表達PIK3CD-AS1后腎癌細胞的增殖 將經(jīng)篩選好的實驗組及陰性對照組細胞消化后，分別取100 μL細胞懸液接種至96孔板，設置濃度梯度為1 000～10 000細胞/孔，每1 000細胞為一梯度，將其放在培養(yǎng)箱中24 h(37 ℃、5%CO2)后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中孵育1～4 h，分別于1、2、3及4 h時通過酶標儀檢測D(450 nm)值。后選取3 000細胞/孔培養(yǎng)1 h進行重復。細胞增殖活力(%)=[D(實驗組)-D(空白組)]/[D(陰性對照組)-D(空白組)]×100。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測過表達PIK3CD-AS1后腎癌細胞的凋亡 將實驗組細胞及陰性對照組細胞分別傳至6孔板，培養(yǎng)箱中孵育24 h(37 ℃、5%CO2)后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，預冷的PBS清洗2次，250 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整濃度為1×106/mL，取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/Alexa Fluor 647和20 μg/mL的碘化錠溶液10 μL，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應管中加400 μL PBS，流式細胞儀(FACS)進行分析。

1.2.5 凋亡相關(guān)基因表達譜芯片 分別抽提實驗組及陰性對照組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，行凋亡相關(guān)基因表達譜檢測。根據(jù)熒光定量PCR試劑說明書，分別加入待測86種凋亡相關(guān)基因以及兩種內(nèi)參的前后引物及其他組分，形成20 μL混合體系，采用標準兩步法行qRT-PCR，檢測各凋亡相關(guān)基因的表達。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達

以HK-2中PIK3CD-AS1表達水平為100%，769-P中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(1.21±1.04)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=165.096，P<0.01)。786-O中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(21.98±18.34)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.037，P<0.05)。A498中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(32.53±30.39)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.846，P<0.05)。由此可見，PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達較正常腎臟細胞明顯降低，尤其是769-P最為明顯。見圖1。

a：P<0.01，b：P<0.05，與HK-2比較

2.2 PIK3CD-AS1穩(wěn)定高表達細胞株的鑒定

在熒光顯微鏡下可見，轉(zhuǎn)染成功的陽性克隆細胞有綠色熒光，見圖2。通過qRT-PCR檢測，陰性對照組細胞中PIK3CD-AS1表達水平較空白組細胞下降到(60.07±32.96)%，差異無統(tǒng)計學意義(t=2.098，P>0.05)。實驗組細胞中PIK3CD-AS1表達水平較空白組細胞上升(40.51±15.64)倍，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.376，P<0.05)。見圖3。

圖2 熒光顯微鏡下觀察PIK3CD-AS1的轉(zhuǎn)染情況

a：P<0.05，與空白組比較

2.3 PIK3CD-AS1過表達抑制腎癌細胞的增殖

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，實驗組細胞的增殖活性較對照組細胞下降到(44.45±12.88)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=-10.562，P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較

2.4 PIK3CD-AS1過表達促進腎癌細胞的凋亡

經(jīng)流式細胞儀分析，實驗組細胞的凋亡率為(15.43±1.33)%，對照組細胞的凋亡率為(10.03±0.65)%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.34，P<0.05)，見圖5。

圖5 流式細胞術(shù)檢測兩組細胞的凋亡率

2.5 PIK3CD-AS1引起腎癌細胞凋亡相關(guān)基因表達譜改變

在凋亡相關(guān)基因表達譜芯片篩選實驗中，經(jīng)3次重復實驗證實，數(shù)據(jù)結(jié)果以實驗組細胞較對照組細胞的基因相對表達倍數(shù)表示，舍棄無效數(shù)據(jù)，選擇3倍以上或者1/3倍以下為表達明顯上調(diào)或者下調(diào)的基因。結(jié)合文獻我們選擇其中部分基因進行再次驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因DFFA、BCL2L1、CASP9有顯著差異，其中實驗組細胞DFFA、BCL2L1表達比對照組明顯下降，而CASP9的表達明顯增高，見圖6。

圖6 過表達PIK3CD-AS1腎癌細胞中DFFA、BCL2L1、CASP9表達量

3 討論

LncRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著廣泛的作用及影響。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4-IT1表達水平與腎細胞癌的組織學分級、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)；在786-O細胞中干擾SPRY4-IT1的表達，可以明顯減慢細胞生長、阻滯細胞生長周期并促進細胞的凋亡。Zhang等[16]還發(fā)現(xiàn)，在腎癌組織和細胞中MALAT-1表達水平比癌旁正常腎臟組織和正常腎小管上皮細胞HK-2中顯著增高；同時，MALAT-1表達高低與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者性別、年齡、組織學分級、遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)。我們對腎癌患者數(shù)據(jù)庫的研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CD-AS1在較多腎癌患者中表達異常，且與腎癌的發(fā)生發(fā)展存在著一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示腎癌細胞中PIK3CD-AS1的表達較正常腎臟細胞顯著下降，PIK3CD-AS1過表達后腎癌細胞增殖活力明顯下降，而凋亡率明顯升高。說明PIK3CD-AS1可抑制腎癌細胞的增殖并促進凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA與腎癌的凋亡存在密切關(guān)系。Chiyomaru等[17]研究顯示，在細胞株786-O和ACHN中，miR-141可抑制HOTAIR表達，從而使惡性腫瘤細胞的凋亡增多。Xue等[18]通過siRNA敲低LncRNA NBAT-l表達后，腫瘤細胞增殖活性明顯提高，流式細胞儀顯示細胞凋亡明顯減少。本研究顯示，PIK3CD-AS1可以增加腎癌細胞的凋亡，且其促凋亡很可能與CASP9、DFFA、BCL2L1基因相關(guān)。細胞凋亡在動物發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起著核心作用，負責執(zhí)行凋亡的基本機制是半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族。CASP9(即caspase-9)是公認的細胞凋亡的啟動因子，CASP9等凋亡因子激活后細胞凋亡的啟動達到高峰[19-20]；我們的結(jié)果表明CASP9在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達明顯上升。DFFA也被稱為caspase激活DNA酶的抑制劑(ICAD)，可抑制細胞凋亡，DFFA在部分惡性腫瘤(如漿液性卵巢癌[21]、食管癌[22])中的表達明顯上調(diào)；而我們發(fā)現(xiàn)DFFA在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達顯著下降。BCL2L1的主要功能是阻止BAX(或BAK1)的激活，從而阻止細胞凋亡[23-24]；我們的結(jié)果顯示BCL2L1在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達顯著下降。由此可見PIK3CD-AS1可能通過與CASP9、DFFA、BCL2L1的相互作用從而加快腎癌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PIK3CD-AS1在腎癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，可作為潛在的腎癌早期診斷、分子靶向治療及預后評估的一項分子標志物。但PIK3CD-AS1在腎癌中的具體作用機制及參與的具體信號通路，尚需進一步探討。