李瀟涵， 閔玉嬌， 潘子輝， 吳皓杰， 王薈， 邵啟祥

(江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

胸腺屬于中樞免疫器官，是T細胞發(fā)育、成熟的重要場所。但嚴重感染、腫瘤放化療等破壞胸腺微環(huán)境，導致胸腺上皮細胞(thymic epithelial cells，TECs)凋亡，胸腺細胞遷出不可逆減少，從而引起胸腺急性萎縮[1]。目前胸腺萎縮機制仍不清楚，因此闡明胸腺萎縮機制，將對嚴重感染、移植排斥反應等引起的T細胞免疫缺陷的重建具有重要的理論意義和臨床價值。

以往的研究表明，胰島素、性激素等多種激素可能是引起胸腺萎縮的主要因子[2-3]。但最近的研究顯示，胸腺細胞上過表達Jagged1會導致TECs凋亡[4]，提示Notch信號很可能也參與了胸腺萎縮的發(fā)生。小鼠出生后，Notch3主要表達于胸腺的髓質(zhì)區(qū)，且其表達高于Notch1，Notch3介導的Notch信號也較Notch1強[5-6]，因此我們推測Notch3的激活導致胸腺上皮細胞凋亡的可能性比Notch1更大。本研究通過在小鼠TECs系mTEC1細胞中過表達Notch3胞內(nèi)活化片段(intracellular domain of Notch3,NICD3)，探討Notch3信號的激活對TECs的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

EdU Apollo?567細胞增殖檢測試劑盒(廣州銳博生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)液(以色列BioInd公司)；胎牛血清(Life Technologies Corporation)；牛血清白蛋白(BSA，湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)；Lip2000(美國Invitrogen公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.3 慢病毒表達載體的構(gòu)建

在基因庫中查詢Notch3基因(NM_008716.2)，顯示NICD3位于其DNA序列的第5 049～7 016位，共計1 968 bp。按照該序列經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成包含EcoR Ι和BamH Ι酶切位點的NICD3的DNA序列。

構(gòu)建方法如下：將合成的NICD3互補的DNA片段退火酶切后插入PSTB-Flag-GFP慢病毒載體，將載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，并經(jīng)過37 ℃ 250 r/min 搖床擴增2 h，然后涂板(具有氨芐西林抗性)培養(yǎng)12～16 h、挑取單個菌落，接種培養(yǎng)12～16 h，最后提取NICD3慢病毒載體，通過酶切與測序驗證慢病毒載體是否構(gòu)建成功。

1.4 NICD3表達載體感染mTEC1細胞

NICD3處理組和空載組均按照目的質(zhì)粒(NICD3質(zhì)粒或空載質(zhì)粒)：pMD2G：psPAX2=3 μg ∶1 μg ∶2 μg的比例加入至200 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，再與含有Lip2000(18 μL)的無血清DMEM(200 μL)培養(yǎng)液混勻，然后均勻滴入到培養(yǎng)有HEK-293T細胞(匯合度在70%左右)的60 mm培養(yǎng)皿中(內(nèi)含4 mL無血清DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)24 h(更換新鮮培養(yǎng)液)和48 h后收取含病毒的上清液并過濾，再將過濾好的病毒液與含10%胎牛血清的DMEM按1 ∶1混勻，加入到培養(yǎng)有mTEC1細胞的60 mm小皿中，培養(yǎng)24 h后(第1次感染)更換新鮮的含病毒上清液的混合液進行共培養(yǎng)，再培養(yǎng)48 h后(第2次感染后24 h)使用熒光顯微鏡觀察有無綠色熒光并拍照記錄，再于同一視野的可見光下觀察細胞密度并拍照記錄，慢病毒感染成功的mTEC1細胞胞質(zhì)可見綠色熒光，發(fā)綠色熒光細胞數(shù)/可見光細胞數(shù)量×100%即為感染效率。然后采用嘌呤霉素進行篩選，并使用熒光顯微鏡觀察篩選后細胞形態(tài)以及發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例。

1.5 EdU法檢測細胞增殖率

將NICD3和空載對照病毒感染后的mTEC1細胞和未感染的mTEC1細胞均按5×103/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，檢測前2 h更換為含EdU的無血清DMEM(1 ∶1 000)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，PBS漂洗2次，采用4%低聚甲醛固定30 min，再以2 mg/mL甘氨酸孵育5 min終止固定，PBS漂洗5 min、0.5% Triton X-100孵育10 min；將Apollo染液以100 μL/孔加入到細胞培養(yǎng)板，避光孵育30 min；棄凈染液，再經(jīng)過TritonX-100孵育10 min、細胞核染色(Hoechst)30 min、PBS漂洗3次(5 min/次)后，于熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)紅色熒光的增殖期細胞數(shù)以及發(fā)藍色熒光的總細胞數(shù)，細胞增殖率=增殖期細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05判斷為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建慢病毒表達載體

使用EcoR Ι和BamH Ι對構(gòu)建的PSTB-NICD3-Flag-GFP進行酶切鑒定，驗證NICD3的DNA片段是否正確插入慢病毒表達載體(圖1)，結(jié)果顯示質(zhì)粒經(jīng)過酶切后目的條帶位于2 000 bp左右，與預期結(jié)果一致，表明NICD3正確插入載體，最后采用測序確認目的基因序列完全正確。

M：標準參照物；1：經(jīng)過酶切的質(zhì)粒；2：未經(jīng)過酶切的質(zhì)粒

2.2 慢病毒表達載體成功轉(zhuǎn)染mTEC1細胞

將包裝后的慢病毒載體感染mTEC1細胞，第2次感染之后24 h通過熒光顯微鏡觀察并經(jīng)計算NICD3慢病毒載體的感染效率約為20%(圖2A)。使用嘌呤霉素進行篩選的過程中，與空載組相比，可能由于NICD3影響了mTEC1細胞的生長，導致感染NICD3慢病毒后的mTEC1細胞(NICD3組)生長緩慢、細胞細長、排列疏松、胞質(zhì)顆粒較多(圖2B)。所以后續(xù)實驗直接采用第2次感染后24 h即未經(jīng)過嘌呤霉素篩選的mTEC1細胞檢測細胞增殖率。

A：篩選前；B：篩選后

2.3 過表達NICD3可抑制mTEC1細胞增殖

EdU增殖實驗結(jié)果顯示，與空白組和空載組比較，NICD3感染組的mTEC1細胞增殖明顯受到抑制(圖3)。使用GraphPad軟件對3次實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析顯示，NICD3感染組(NICD3)細胞增殖率約為40%左右，明顯低于空載組和空白對照組(P<0.01)，說明NICD3過表達可抑制mTEC1細胞增殖。

3 討論

Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體和CSL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子3部分組成，參與細胞生長發(fā)育的多個過程[7]。脊椎動物中有4種Notch受體(Notch 1～4)和5種Notch配體(Jagged1,2和Delta-like1,3,4)。Notch受體和Notch配體均位于細胞表面，均為單次跨膜糖蛋白，當配體與受體結(jié)合后，Notch受體經(jīng)過2次裂解釋放出NICD，NICD進入細胞核后，改變CSL的構(gòu)象，使CSL對Notch靶基因的抑制轉(zhuǎn)為激活，從而調(diào)節(jié)下游Hes1、Hey、Deltex1等基因的轉(zhuǎn)錄[8]。

以往的研究多集中在胸腺中Notch信號對T細胞發(fā)育的作用，例如Notch信號對TCR的表達以及胸腺細胞發(fā)育分化的影響，而對Notch信號在TECs中的作用研究相對較少[9-12]。

4種不同的Notch受體被激活后可能發(fā)揮不同的作用[5]。研究表明Notch2在所有人體造血干細胞以及T細胞發(fā)育過程中穩(wěn)定低表達。Notch4相對局限于活化的巨噬細胞、胰腺細胞等，而在胸腺中很少表達[13]。研究發(fā)現(xiàn)Jagged1可誘導TEC退化，而Notch3在出生后表達上調(diào)，因此我們推測Jagged1可能主要通過Notch3介導TECs的衰老和退化。

我們在前期實驗中已經(jīng)證實Notch信號的活化可對mTEC1細胞產(chǎn)生影響[14]，因此本研究中我們采用NICD3慢病毒載體轉(zhuǎn)染mTEC1細胞，觀察活化的Notch3信號對TECs的影響，結(jié)果表明Notch3信號的活化可抑制mTEC1細胞的增殖。而相關(guān)研究表明胸腺退化萎縮時胸腺微環(huán)境會發(fā)生改變，胸腺上皮細胞的生長發(fā)育常常受到影響，胸腺微環(huán)境的破壞最終導致胸腺細胞遷出不可逆減少[1,15]，并且這種減少臨床上很難重建。我們的實驗結(jié)果提示阻斷胸腺上皮細胞的Notch3信號有可能促進胸腺上皮細胞的增殖，從而延緩胸腺萎縮的發(fā)生，為后期研究Notch3信號調(diào)控TECs衰老和退化的分子機制提供了參考資料，并可能為臨床防治嚴重感染、移植排斥反應等導致的T細胞免疫缺陷提示了方向。

但NICD3進入細胞核以后通過激活哪些靶基因來進行調(diào)節(jié)目前仍不清楚。有研究表明Notch信號下游靶基因Hes1的激活可抑制細胞增殖[16]。那么在過表達NICD3的mTEC1細胞中Hes1是否也發(fā)揮了重要作用，仍需要進一步研究。