楊蕭天， 蘇兆亮， 徐岷

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)系， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

結(jié)腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，占所有腫瘤的10%，每年新增患者136萬例，死亡人數(shù)超過50萬[1]。臨床上多數(shù)結(jié)腸癌患者出現(xiàn)癥狀時，都已經(jīng)是中晚期并出現(xiàn)了腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯失了治療時機(jī)。最近研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，在乳腺癌中，血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)的異常表達(dá)以及TNF-α的異常表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[2-4]。關(guān)于Ang Ⅱ在結(jié)腸癌中的表達(dá)及影響尚不清楚，因此，我們擬檢測Ang Ⅱ 及其受體阻滯劑對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株的生物學(xué)行為和TNF-α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株 (美國ATCC細(xì)胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；PBS和0.25%胰酶(美國HyClone公司)；兔源AT1R抗體(臺灣Arigo公司)；小鼠來源的TNF-α、β-肌動蛋白抗體及熒光二抗購于武漢ABclonal公司；DAPI細(xì)胞核染液購于碧云天公司；CCK8試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；TNF-α ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物工程有限公司；Transwell小室(美國Corning公司)；基質(zhì)膠(美國BD公司)；Ang Ⅱ和氯沙坦(美國Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CT26細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并置于37 ℃，5%CO2的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光法檢測CT26細(xì)胞AT1R的表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個,孵箱培養(yǎng)24 h;棄上清液，取出細(xì)胞玻片，置于新的24孔板中，PBS浸洗3次，每次3 min；4%低聚甲醛固定20 min；PBS浸洗3次，每次5 min；0.5%Triton X-100通透10 min；PBS洗3次，每次5 min；BSA室溫封閉30 min；PBS浸洗3次，每次5 min；每張爬片滴加用PBS稀釋的AT1R一抗(1 ∶500)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；次日棄去一抗殘余液，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加PBS稀釋的熒光二抗(1 ∶500)于細(xì)胞玻片上，室溫避光孵育1 h；PBS浸洗3次，每次5 min；于室溫避光條件下用DAPI染核10 min；PBS 洗3次，每次5 min；直接于熒光顯微鏡下觀察AT1R的表達(dá)并拍攝圖片。

1.4 CCK8法檢測CT26細(xì)胞增殖率

取對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3×103個。細(xì)胞貼壁后，分別加入3種濃度Ang Ⅱ(1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L)；每組設(shè)3個復(fù)孔；孵育72 h后，分別加入CCK8試劑(終濃度100 μL/mL)并于37 ℃，5%CO2恒溫箱中溫育1.5 h；用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取D值，根據(jù)D值計算細(xì)胞增殖率；選擇最適濃度的Ang Ⅱ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3×103個。待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入3種不同濃度的氯沙坦(1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L)以確保氯沙坦與AT1R結(jié)合；每組設(shè)3個復(fù)孔，預(yù)處理2 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入含1×10-7mol/L Ang Ⅱ的培養(yǎng)液；孵育72 h后，分別加入CCK8試劑(終濃度100 μL/mL)并在37 ℃，5%CO2恒溫箱中溫育1.5 h；用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取D值，根據(jù)D值計算細(xì)胞增殖率；選取最適濃度的氯沙坦進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CT26細(xì)胞侵襲能力

在Transwell上室內(nèi)加入70 μL稀釋的基質(zhì)膠，下表面涂以5%的明膠15μL，置于超凈臺中風(fēng)干過夜，次日加入200 μL RPMI 1640培養(yǎng)液水化2 h；于24孔板內(nèi)加入700 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640；收集對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，用無血清的RPMI 1640制成3×105/mL的細(xì)胞懸液，以300 μL體系加入Transwell上室：對照組下室不作處理；Ang Ⅱ組下室加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；氯沙坦+Ang Ⅱ組先用1×10-6mol/L氯沙坦預(yù)處理2 h，下室加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；每組設(shè)平行小室3個，在37 ℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)12 h；取Transwell小室，低聚甲醛固定20 min；用棉簽小心擦去未穿膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10 min；在倒置顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.6 ELISA法檢測CT26細(xì)胞TNF-α含量

將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個；細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)24 h，換用無血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞分為對照組、AngⅡ組、氯沙坦+Ang Ⅱ組。對照組不作處理；AngⅡ組加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；氯沙坦+Ang Ⅱ組加入1×10-6mol/L氯沙坦預(yù)處理2 h，棄培養(yǎng)液，再加入含1×10-7mol/L Ang Ⅱ的無血清培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，收取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測CT26細(xì)胞AT1R及TNF-α蛋白的表達(dá)

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于24孔板，每孔細(xì)胞計數(shù)為2×105個，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分組，分組及每組處理同“1.6”；常規(guī)培養(yǎng)24 h后，收取各組CT26細(xì)胞；裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行凝膠電泳(12% SDS-PAGE)，每孔蛋白上樣量為15 μL；待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部時，停止電泳；采用濕式轉(zhuǎn)膜裝置將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；膜于BSA封閉液中室溫封閉1 h；滴加稀釋好的兔抗AT1R(1 ∶1 000)、鼠抗TNF-α(1 ∶500)和鼠抗β-肌動蛋白(1 ∶2 000)，置于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入羊抗兔和羊抗鼠IgG(1 ∶2 000)二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL試劑，在化學(xué)發(fā)光成像儀下觀察并拍攝圖像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CT26細(xì)胞AT1R的表達(dá)

在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光分布，綠色熒光為AT1R，細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光(DAPI)，結(jié)果表明AT1R表達(dá)于CT26細(xì)胞(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測CT26細(xì)胞AT1R的表達(dá)

2.2 Ang Ⅱ及氯沙坦對CT26細(xì)胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比，1×10-7moL/L Ang Ⅱ組細(xì)胞增殖率明顯升高(t=16.446，P<0.05)，而1×10-9moL/L及1×10-8moL/L Ang Ⅱ組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。故選用1×10-7moL/L的 Ang Ⅱ作為最適濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與Ang Ⅱ組相比，1×10-7moL/L及1×10-6moL/L氯沙坦組細(xì)胞增殖率明顯降低(t=5.765，t=12.429，P<0.05)，而1×10-8moL/L氯沙坦組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。故選用1×10-6moL/L的氯沙坦作為最適濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a: P<0.05，與對照組相比

a：P<0.05，與1×10-7moL/L Ang Ⅱ組比較

2.3 AngⅡ及氯沙坦對CT26細(xì)胞侵襲能力的影響

體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增多(t=7.24，P<0.05)；與Ang Ⅱ組相比，氯沙坦+Ang Ⅱ組細(xì)胞侵襲的數(shù)量明顯減少(t=5.856，P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組比較

2.4 AT1R表達(dá)及TNF-α蛋白的分泌與表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示(圖4)，與對照組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞上清液中TNF-α含量明顯升高(t=10.277，P<0.05 )；氯沙坦+Ang Ⅱ組細(xì)胞分泌的TNF-α較Ang Ⅱ組明顯降低(t=8.693，P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞TNF-α表達(dá)量增多(t=17.298，P<0.05)；氯沙坦+Ang Ⅱ組腫瘤細(xì)胞TNF-α表達(dá)量較Ang Ⅱ組明顯減少(t=14.599，P<0.05)；與ELISA檢測結(jié)果相一致。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，Ang Ⅱ組AT1R表達(dá)量明顯增多(t=14.738，P<0.05)；與Ang Ⅱ組比較，氯沙坦+Ang Ⅱ組AT1R表達(dá)量顯著降低(t=12.571，P<0.05，圖6)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組比較

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組相比

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲是腫瘤惡化的主要原因。Ang Ⅱ參與多種腫瘤的調(diào)控，以往對Ang Ⅱ的研究主要集中于心血管疾病[5]，自1998年，Lever等[6]報道，接受血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑治療的高血壓患者的腫瘤發(fā)生率明顯降低。研究表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與腫瘤的發(fā)展，Ang Ⅱ通過激活A(yù)T1R促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[3,7-8]。本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可以激活并上調(diào)AT1R的表達(dá)，并且促進(jìn)CT26細(xì)胞的增殖和侵襲能力。也有研究發(fā)現(xiàn)，ARB類藥物可以與AT1R特異性結(jié)合，從而阻止AngⅡ與AT1R的結(jié)合，達(dá)到抑制AngⅡ的作用[9-11]。本研究采用氯沙坦作為AT1R的阻滯劑，結(jié)果顯示，氯沙坦預(yù)處理CT26細(xì)胞后，AngⅡ的促腫瘤增殖和侵襲作用受到明顯抑制。由此推測，當(dāng)Ang Ⅱ作用于CT26細(xì)胞后促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組相比

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ在促進(jìn)腫瘤增殖和侵襲的過程中，上調(diào)了TNF-α的表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有抗腫瘤作用[12-13]；近來研究發(fā)現(xiàn)， TNF-α也參與多種腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，包括胰腺癌、前列腺、卵巢腫瘤等[14-18]；TNF-α可以通過上調(diào)MMP9、血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。TNF-α在腫瘤中的雙重作用值得進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果提示，Ang Ⅱ可能通過激活TNF-α促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲。

氯沙坦已廣泛應(yīng)用于高血壓病及腎臟疾病的治療，未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[19]，且經(jīng)濟(jì)、易獲取，可應(yīng)用于臨床抗腫瘤的治療。綜上所述，Ang Ⅱ增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，激活并上調(diào)TNF-α的表達(dá)，氯沙坦通過與AT1R的特異性結(jié)合抑制Ang Ⅱ促腫瘤增殖和侵襲的作用，但在侵襲方面的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。