李 銳, 文正勇*, 覃川杰, 鄒遠(yuǎn)超,王 均, 賀 揚(yáng), 袁登越

(1. 內(nèi)江師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 內(nèi)江 641100；2. 內(nèi)江師范學(xué)院 長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室， 四川 內(nèi)江 641100)

肌動蛋白(actin)是構(gòu)成細(xì)胞的基本骨架主要成分，廣泛分布于動植物等真核生物細(xì)胞中，主要參與細(xì)胞的分裂、細(xì)胞器運(yùn)動、染色體運(yùn)動、細(xì)胞激化、mRNA加工和運(yùn)輸?shù)仍S多重要生理過程[1-3].肌動蛋白家族包括6種異構(gòu)體、2種平滑肌型(α-血管平滑肌型和γ-內(nèi)臟平滑肌型)、2種橫紋肌型(α-骨骼肌型和α-心肌型)和2種細(xì)胞質(zhì)型(β-細(xì)胞質(zhì)型和γ-細(xì)胞質(zhì)型)[4-5].β-actin的氨基酸序列在脊椎動物中十分保守：劉秀霞等[5]報道魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類等不同類群脊椎動物β-actin氨基酸序列同源性均在96%以上；覃川杰等[6]報道寬體沙鰍(Sinibotiareevesae)的β-actin氨基酸序列與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等無脊椎動物具有較高的同源性，與鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、小白鼠(Musmusculus)等脊椎動物的同源性高達(dá)95%～99%，提示該基因的生理功能在不同物種之間具有很高的保守性.此外，β-actin在不同的組織細(xì)胞中能較高較穩(wěn)定地表達(dá)，且不容易隨年齡的變化而改變，因此在研究某基因的mRNA相對表達(dá)量時，β-actin常常被用作內(nèi)標(biāo)基因[7].目前，包括鱖魚(Sinipercachuatsi)[5]、寬體沙鰍[6]、黃鱔(Monopterusalbus)[8]、鳡魚(Elopichthysbambusa)[9]、松江鱸魚(Trachidermusfasciatus)[10]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[11]等在內(nèi)的多種硬骨魚類β-actin基因已經(jīng)被成功克隆，將為這些魚類功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究奠定良好的基礎(chǔ).

烏鱧(Channaargus)隸屬鱸形目(Perciformes)、攀鱸亞目(Anabantoidei)、鱧科(Channidae)鱧屬(Channa)，又叫財魚、烏魚、黑魚、生魚、斑魚等，俗稱烏棒，是一種兇猛的肉食性魚類.烏鱧營養(yǎng)豐富、味道鮮美，一直被認(rèn)為是食療和滋補(bǔ)的佳品[12].目前我國除新疆、西藏地區(qū)外，其他省份各大水系均有分布[13].烏鱧作為我國的大宗水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，對我國的國民經(jīng)濟(jì)收入具有較大的貢獻(xiàn)，據(jù)2016年中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計，2015年我國烏鱧總產(chǎn)量49.5萬t，在大宗淡水養(yǎng)殖魚類中排第9位.同時，烏鱧作為特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，對四川的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)也具有重要貢獻(xiàn)：2015年四川省烏鱧產(chǎn)量8 977 t，占全國總產(chǎn)量1.8%，且產(chǎn)量逐年上升.內(nèi)江地處成渝之間，擁有川南最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖水面，水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量位居四川前三，同時也是烏鱧主養(yǎng)區(qū)之一.隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，對烏鱧在分子生物學(xué)方面的研究越來越多：胃蛋白酶原基因[14]、腦型芳香化酶基因[15]、MHC[16]、STAT1[17]及Foxl2[18]等許多功能基因被克隆，這些功能基因的轉(zhuǎn)錄水平研究都需要管家基因作為內(nèi)標(biāo)，β-actin已廣泛作為內(nèi)參基因使用，對其進(jìn)行研究顯得十分重要.本研究首次克隆了烏鱧的β-actin基因的cDNA序列，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步對其組織表達(dá)進(jìn)行了檢測，以期為其他功能基因的研究以及轉(zhuǎn)基因烏鱧的生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1試驗用魚及暫養(yǎng)管理試驗用烏鱧購于內(nèi)江市桂湖街農(nóng)貿(mào)市場，為人工養(yǎng)殖烏鱧，暫養(yǎng)于內(nèi)江師范學(xué)院長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室.烏鱧暫養(yǎng)于100 L水族箱中，水溫(22±0.5) ℃，水體溶氧保持在(7.5±0.6) mg·L-1之間，且每2 d換水族箱中的水約1/3，新?lián)Q用水均有充分曝氣.每天晚上7點(diǎn)投喂餌料，餌料占體質(zhì)量比為5%，未吃完餌料及時撈出.

1.2組織樣品獲得經(jīng)暫養(yǎng)2周后，選取健康無病、活力好的4尾烏鱧用于試驗(其中1尾用于克隆，另3尾用于組織分布)，平均體質(zhì)量為(150±5.6) g.試驗魚經(jīng)MS-222麻醉后，置于冰上并迅速取出腦、肝臟、心臟、肌肉、脂肪(腸系膜脂肪)、脾臟、腎臟(中腎)、胃、眼、鰓、性腺共11個組織，樣品立即放入液氮中冷凍，然后放于-80 ℃冰箱備用.

1.3β-actin基因cDNA序列克隆將健康烏鱧解剖后，取適量肝臟組織，利用Trizol法提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用Eppendorf核酸分析儀測定其濃度，并取1 μg總RNA按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成第一鏈cDNA，保存于-80 ℃冰箱備用.

從實(shí)驗室測得的烏鱧性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(未公布)中獲得β-actin的mRNA部分核心序列片段，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對確認(rèn)后，結(jié)合GenBank已公布的其他魚類β-actin保守序列設(shè)計兩對性引物，分別是:

cDNA-F1:5′-CACGCGTAACTCACCTGAAC-3′,

cDNA-R1:5′-GGCATACAGGTCTTTACGG-3′，

cDNA-F2:5′-CCTTCCTTCCTCGGTAT-3′,

cDNA-R2:5′-GCACTTTATTGGGATTGTT-3′.

以烏鱧肝臟cDNA為模版，進(jìn)行RCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，共計34個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后，用TaKaRa膠回收試劑盒分離純化，再與pMD18-T克隆載體連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5,挑取陽性克隆送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測序.

1.4β-actin序列分析根據(jù)測序結(jié)果拼接組裝獲得烏鱧β-actin的cDNA序列，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫作BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對分析，通過在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測烏鱧β-actin的開放閱讀框，進(jìn)一步用Primer 5.0軟件預(yù)測蛋白序列，并將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫.通過Motif Scan程序(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)分析烏鱧β-actin蛋白的功能位點(diǎn)，TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜結(jié)構(gòu)，并用DNAMAN 8.0軟件分析烏鱧β-actin蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等特征.

1.5分子系統(tǒng)發(fā)育分析通過BLAST比對，從GenBank下載獲得的其他物種的β-actin核酸序列和蛋白序列，選取大西洋鮭、虹鱒、斑馬魚、烏鱧、爪蟾、小白鼠和人共7個物種的蛋白序列用BioEdit 7.1軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析.由于β-actin在不同物種間蛋白序列具有很高的保守性，因此選用核苷酸序列進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析[5].選取22個物種的β-actin核酸序列，通過ClustalX 2.0[19]進(jìn)行多重序列比對分析，用DAMBE軟件[20]進(jìn)行各序列的堿基替代飽和性檢驗，然后用MEGA 6.0軟件[21]，采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)，構(gòu)建烏鱧及其他21個物種β-actin基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(序列信息見表1)，并用Bootstrap重復(fù)1 000次計算各分支的置信度.

表 1 用于進(jìn)化分析的物種序列信息

1.6β-actin組織表達(dá)用Trizol法提取各組織總RNA.各組織RNA經(jīng)混合后，取1 μg RNA按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA，以特異性引物:

β-actin qF:5′-CTCCACTCAACCCCAAAG-3′,

β-actin qR:5′-GAGCGTAGCCCTCATAGA-3′

進(jìn)行半定量PCR.PCR擴(kuò)增體系為：dd H2O 20.25 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板0.5 μL、rTaq酶0.25 μL，共計25 μL體系.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共計34個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠圖像采集系統(tǒng)中采集圖像.

2 結(jié)果

2.1烏鱧β-actincDNA序列的克隆與特征分析以烏鱧肝臟cDNA為模板，擴(kuò)增獲得長度為909和965 bp兩個PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)過測序及組裝后，得到一個全長為1 813 bp的烏鱧β-actin cDNA序列.序列經(jīng)BLAST比對確認(rèn)后，上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號：KX925979).經(jīng)預(yù)測，烏鱧β-actin cDNA序列包含一個1 125 bp的開放閱讀框(ORF)，共編碼375個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA；蛋白功能位點(diǎn)分析顯示，在氨基酸序列的53～63位、104～116位及356～364位是烏鱧的β-actin信號位點(diǎn)；在cDNA末段發(fā)現(xiàn)了PloyA加尾信號(aataaa)(圖1).

圖 1 烏鱧β-actin cDNA序列及推導(dǎo)氨基酸序列

2.2烏鱧β-actin序列特征分析烏鱧β-actin蛋白由375個氨基酸組成，預(yù)測相對分子質(zhì)量約為41.73 kDa，理論等電點(diǎn)PI為5.16，由20種氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)數(shù)目占比最高為7.73%，色氨酸(Trp)數(shù)目占比最低為1.07%(圖2).跨膜預(yù)測結(jié)果顯示，烏鱧β-actin蛋白沒有跨膜區(qū).多重序列比對顯示:β-actin蛋白序列在各物種之間具有很高的保守性，除了個別位點(diǎn)存在氨基酸替換外，其余氨基酸序列完全相同.與魚類相比，烏鱧的β-actin蛋白序列第2位氨基酸是天冬氨酸(Asp)而大西洋鮭和虹鱒的第2位氨基酸是谷氨酸(Glu)，烏鱧β-actin蛋白序列的第319位氨基酸由絲氨酸(Ser)替換為丙氨酸(Ala)；與四足類動物相比，烏鱧β-actin蛋白序列的第228位氨基酸是甘氨酸(Gly),而四足類動物是丙氨酸(Ala)，烏鱧的第279位氨基酸是酪氨酸(Tyr),而小鼠和人是苯丙氨酸(Phe)(圖3).

圖 2 烏鱧β-actin氨基酸組成分析

圖 3 烏鱧與其他動物β-actin氨基酸序列的多重比對

2.3烏鱧β-actin氨基酸與其他物種的同源性分析基于β-actin氨基酸的同源性分析顯示，烏鱧與其他18種動物的β-actin蛋白序列同源性很高，均在98%以上.其中，與人的同源性最低為98.4%，與黃鱔、莫桑比克羅非魚、石斑魚的同源性最高為99.4%,與斑馬魚、大鱗大麻哈魚、大西洋鮭、鳡、黑棘鯛、虹鱒、鯽魚、軍曹魚、鯪魚、塞內(nèi)加爾鰨、星斑川鰈、非洲爪蟾、雞及小家鼠等動物的同源性介于這兩者之間(見表2).

2.4烏鱧β-actin基因系統(tǒng)發(fā)育分析用DAMBE軟件對烏鱧等22種動物的β-actin核苷酸序列進(jìn)行了核苷酸替代飽和性檢驗，結(jié)果表明該基因的堿基替換率均未達(dá)飽和，具有系統(tǒng)發(fā)育意義.基于Kimura雙參數(shù)模型用MEGA 6.0軟件以鄰接法構(gòu)建了β-actin基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4.烏鱧首先與大西洋鮭、虹鱒、鱖魚、金頭鯛、羅非魚等鱸形目魚類聚類為一支，再與人、家鼠、變色龍等脊椎動物構(gòu)成的單支并列聚合為一起，最后再與斑馬魚、鯽魚等鯉形目魚類聚為一支，非洲爪蟾和原雞處于進(jìn)化樹的根部.系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與烏鱧的分類地位基本一致.

圖 4 基于β-actin核苷酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

表 2 烏鱧β-肌動蛋白與其他動物的同源性比較%

2.5烏鱧β-actin組織表達(dá)分析用獲得的烏鱧β-actin cDNA序列跨內(nèi)含子設(shè)計一對PCR引物，以各組織cDNA為模版進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測.結(jié)果顯示，β-actin基因在烏鱧肝臟、鰓、腦、眼、心臟、腎臟、肌肉、性腺、胃、脾臟、脂肪等組織均有表達(dá)，且特異性很高，PCR產(chǎn)物條帶亮度除了在性腺組織中略低外，在其他各組織的亮度差別不大,結(jié)果如圖5所示.

圖 5 烏鱧β-actin基因組織表達(dá)

3 討論

本研究利用RT-PCR的方法克隆獲得了烏鱧β-actin基因的cDNA全序列.序列全長1 813 bp，包含一個1 125 bp的開放閱讀框，共編碼375個氨基酸，與鱖魚[5]、寬體沙鰍[6]、鳡魚[9]、大鱗副泥鰍[11]等魚類編碼的氨基酸數(shù)目一致.氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，烏鱧β-actin除個別氨基酸與其他脊椎動物有差異，其余的氨基酸序列完全相同，氨基酸序列高度相似性可能與β-actin具有相同的生理功能密切相關(guān)[3,6].氨基酸序列分析顯示，烏鱧β-actin蛋白具有3個actin信號位點(diǎn)，這一結(jié)果與鱖魚[5]和寬體沙鰍[6]相同，進(jìn)一步表明不同魚類具有相同的生理功能.跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明，烏鱧β-actin蛋白不存在跨膜域結(jié)構(gòu)，不屬于膜蛋白，此結(jié)果與寬體沙鰍具有3個跨膜域的結(jié)果不一致，可能與預(yù)測軟件不同有關(guān).此外，氨基酸組成分析顯示，烏鱧β-actin由20種氨基酸組成，其中甘氨酸(Gly)數(shù)目占比最高為7.73%，色氨酸(Trp)數(shù)目占比最低為1.07%，這一結(jié)果與寬體沙鰍等其他動物的氨基酸含量保持一致.氨基酸同源性分析顯示，烏鱧β-actin蛋白序列與斑馬魚、虹鱒、黃鱔、莫桑比克羅非魚、石斑魚、非洲爪蟾、小鼠、人等動物的同源性很高，均在98%以上，這一結(jié)果與鱖魚[5]、寬體沙鰍[6]、鳡魚[9]等其他魚類的研究結(jié)果相同，進(jìn)一步闡述了β-actin蛋白在不同物種之間的保守性.

許多學(xué)者認(rèn)為，由于β-actin蛋白的氨基酸序列在不同物種之間的高度保守性，因此以氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果不能反映真實(shí)的物種之間的進(jìn)化關(guān)系，而以核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹較為科學(xué)[5,9].本研究以β-actin核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，烏鱧首先與大西洋鮭、虹鱒、鱖魚、金頭鯛、羅非魚等鱸形目魚類聚為一支，再與人、家鼠、變色龍等脊椎動物構(gòu)成的單支并列聚合為一起，最后再與斑馬魚、鯽魚等鯉形目魚類聚為一支，非洲爪蟾和原雞處于進(jìn)化樹的根部.表明β-actin基因的進(jìn)化與物種的進(jìn)化歷程保持基本一致，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[5，9]等觀點(diǎn)一致.

由于β-actin在不同的組織細(xì)胞中能較高較穩(wěn)定地表達(dá)，且不容易隨年齡的變化而改變，因此常常作為內(nèi)標(biāo)基因，廣泛應(yīng)用于功能基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究[7].組織表達(dá)分析顯示，烏鱧β-actin基因在肝臟、鰓、腦、眼、心臟、腎臟、肌肉、性腺、胃、脾臟、脂肪等組織均有表達(dá)，且PCR產(chǎn)物條帶亮度除了在性腺組織中略低外，在其他各組織的亮度差別不大，表明烏鱧β-actin基因在各組織表達(dá)相對恒定，可以作為內(nèi)標(biāo)基因的候選基因.這一結(jié)果與寬體沙鰍的研究結(jié)果[6]一致，但與大鱗副泥鰍的研究結(jié)果[11]不一致，表明β-actin基因的組織分布仍然具有一定的物種特異性，這可能與動物體的生活環(huán)境及生理狀態(tài)等因素有關(guān).

4 結(jié)論

本研究成功克隆并獲得了烏鱧β-actin基因的全長cDNA，并對該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了分析，進(jìn)一步構(gòu)建了該基因在不同物種之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，最后對該基因的組織分布進(jìn)行了檢測.本文首次研究了烏鱧β-actin基因，將為今后烏鱧其他功能基因的研究提供基礎(chǔ)資料，同時也為烏鱧β-actin基因的啟動子研究以及轉(zhuǎn)基因烏鱧的培育奠定理論基礎(chǔ).