劉 剛, 伍佩珂, 蔣小妹, 汪淑芳, 張曉喻, 楊秋萍, 李學理, 吳鳳蘭

(1. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101；2. 四川師范大學 食品功能及加工應用研究所, 四川 成都 610101)

桂花(OsmanthusfragransLour.)是木犀科木犀屬的小喬木[1]，原產(chǎn)我國西南部，主要分布于廣西、湖南、貴州及福建等地區(qū)[2].中國南嶺以北到秦嶺以南的中亞熱帶和北亞熱帶(北緯24°～33°)，是桂花集中分布和栽培的地區(qū)[3].桂花花朵的營養(yǎng)價值高、民間習用歷史久遠，早在漢朝就已廣泛應用于食品、香料、酒、茶等行業(yè)，研究也較多[4-5].桂花的果實可入藥，有化痰、生津、暖胃、平肝的功效，其枝葉及根可煎汁敷患處，具有活筋骨、止疼痛的功效[6].有研究表明，桂花果皮作為未充分利用的副產(chǎn)物,含有多種功效成分[7-8].如蒽醌類化合物，其具有抑菌、抗腫瘤、止血等作用,含有的有機酸具有抗菌、利膽、升白等作用,其黃酮類化合物有抗菌、抗病毒、解痙攣等作用,桂花果皮中的黑色素還具有抗氧化活性[9].研究桂花果皮提取物的抗菌活性，具有重要意義.

金黃色葡萄球菌S.aureus是重要的條件致病菌[10]，屬革蘭氏陽性菌，它不僅易引發(fā)許多嚴重感染，而且還可產(chǎn)生具有較強細胞毒性的腸毒素.大腸桿菌E.coli是人類及各類溫血動物腸道中的正常寄居菌，屬于革蘭氏陰性菌.大腸桿菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌[11]，如果食品、飲水中檢測出該菌，就意味著該食物可能直接或間接受到了糞便的污染[12].本實驗研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為目標檢測微生物，研究桂花果皮醇提物的抑菌活性，并進一步研究桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，從而評價其抗氧化活性.近年來，對桂花油脂類功能的研究較多[13-14]，但是，對桂花果皮醇提物的抑菌及抗氧化活性，目前尚未見文獻報道.

1 材料和方法

1.1材料與文獻[1]對照，在四川師范大學成龍校區(qū)采集的植物材料，鑒定為桂花(O.fragrans)，采集其果實后，去雜清洗，分離出種子與果皮.果皮置60 ℃干燥，粉碎，過20～40目篩，備用.桂花果皮醇提物的制備：稱取桂花果皮25.00 g，按1∶20比例加入體積分數(shù)70%乙醇，60 ℃水浴回流提取1 h，重復2次，過濾，合并過濾液，濃縮至50 mL(以生藥量計500 mg/mL)，冷藏備用.

1.2測試菌種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均由四川師范大學生命科學學院實驗室提供.分別取出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌各0.1 mL，接種到20 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑選生長健壯的菌落，再接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h活化菌種，備用.參照文獻 [15]的方法，制備菌懸液：分別取活化菌種各0.1 mL，置于20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.紫外可見分光光度計625 nm處測定OD值，加無菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，調節(jié)菌懸液體積使其OD值在0.08～0.13，此時每毫升菌懸液的活菌數(shù)(CFU，培養(yǎng)單位)即為108CFU/mL.測定時，再加適量無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，使菌懸液的活菌數(shù)稀釋到105CFU/mL.

1.3儀器R-1005型旋轉蒸發(fā)儀，上海予華儀器設備有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；HH.W21型恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LDZX-50KB型立體壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ESJ205-4型電子分析天平，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；DHG-9240型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，日本島津科學儀器公司.

1.4試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司),乙醇、甲醇、DPPH、ABTS(成都市長征化玻有限公司),其余試劑為分析純.

1.5桂花果皮醇提物的抑菌活性

1.5.1濾紙片擴散法 參照文獻[16]方法，根據(jù)有無抑菌圈、抑菌圈直徑判定提取物的抑菌活性.用打孔器制備5 mm濾紙圓片，滅菌后烘干.分別將10 μL一定質量濃度桂花皮醇提取物滴在各濾紙圓片上，以體積分數(shù)75%乙醇為陽性對照，以蒸餾水為空白對照.分別移取0.1 mL菌懸液，用滅菌的涂布棒均勻涂布到牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基，用無菌鑷子夾取各處理過的濾紙片，置于培養(yǎng)基上，每皿貼4張.37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，重復3次.

1.5.2比濁法 參照文獻[17]方法，測定醇提物的抑菌活性.以體積分數(shù)75%乙醇為陽性對照，以只加0.10 mL菌懸液、4.90 mL培養(yǎng)基為空白對照.將桂花皮醇提物稀釋成不同的濃度，分別吸取0.10 mL加入裝有4.8 mL無菌液體培養(yǎng)基的一系列試管，再加入0.10 mL菌懸液，塞上棉塞，震蕩混勻.在37 ℃條件培養(yǎng)24 h.用液體培養(yǎng)基調零，600 nm處測定各個試管的OD值，重復3次.

1.5.3測定最小抑菌濃度(MIC) 參照文獻[18]方法，采用試管2倍稀釋法測定醇提物的最小抑菌質量濃度.取2組各9支無菌試管，每管各加2.00 mL滅菌培養(yǎng)基，先在第1支試管中加桂花皮醇提物2.00 mL，混勻后吸出2.00 mL置于第2支試管，混勻后再吸取2.00 mL至第3支試管，如此連續(xù)稀釋至第7管，混勻后棄去2.00 mL；第8支試管不加提取物，作為空白對照；第9支試管不加細菌只加提取物2.00 mL，混勻后棄去2.00 mL，觀察提取物是否有污染.第二組的1～7支試管，分別加入0.1 mL的105CFU/mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果.與第8、9支試管比較，第1～7支試管中不發(fā)生混濁變化的最高提取物稀釋倍數(shù)的濃度，即為MIC值，重復測定3次.

1.6桂花果皮醇提物的抗氧化活性參照文獻[19-20]方法，分別測定桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，評價其抗氧化活性.

1.6.1清除DPPH·的活性 分別取質量濃度25、50、100、125、200、250 mg/mL的醇提取溶液各200 μL置于試管，各加3.8 mL質量濃度為80 mg/L的甲醇-DPPH溶液，混勻，避光1 h，515 nm處測得樣品吸光度值(Ai).以不加樣品，加體積分數(shù)70%乙醇的甲醇-DPPH溶液為空白，測得空白吸光度值(A0)；以無甲醇-DPPH溶液為對照，測得對照吸光度值(Aj).以3.8 mL甲醇加200 μL的體積分數(shù)70%乙醇為調零溶液，實驗重復3次.按公式計算清除率：

DPPH·清除率(%)=

[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，

Ai為樣品吸光度值；Aj為對照吸光度值；A0為空白吸光度值.

1.6.2清除ABTS·的活性 先將ABTS溶液與過硫酸鉀溶液等體積混合，置暗處12 h，再用甲醇稀釋，直到在734 nm處吸光度值達到0.688～0.702，即得ABTS·溶液.分別取不同質量濃度樣品200 μL，各加入3.8 mL的ABTS·溶液，靜置1 min，在734 nm處測得樣品吸光度值(Ai)；再取3.8 mL 的ABTS·溶液與適量體積的體積分數(shù)70%乙醇，混合后測得空白吸光度值(A0).200 μL的體積分數(shù)70%乙醇和3.8 mL蒸餾水混合，作為調零空白液.實驗重復3次，按公式計算清除率：

ABTS·清除率(%)=(1-Ai/A0)×100%,

其中,Ai為樣品吸光度值，A0為空白吸光度值.

1.7統(tǒng)計與分析用SPSS 17.0軟件進行方差分析，多重比較用LSD法[21]，結果以means±std表示.

2 結果與分析

2.1濾紙片擴散法測定的抑菌活性采用濾紙片擴散法，在牛肉膏固體培養(yǎng)基，分別測定桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結果見表1.

從表1可知，與無菌水空白比較，桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用，差異極顯著(P<0.01)，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm，抑菌效果為低敏，而對大腸桿菌的抑菌圈(10.09±0.605) mm，抑菌效果為中敏.而與體積分數(shù)75%的乙醇比較，桂花果皮醇提物對這兩種菌的抑菌效果均有顯著或極顯著的差異.桂花果皮醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm較體積分數(shù)75%乙醇的抑菌圈(6.37±0.187) mm大，而對大腸桿菌的抑菌圈為(10.09±0.605) mm也較體積分數(shù)75%乙醇的抑菌圈(6.67±0.255) mm更大.

表1 桂花果皮醇提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性(n=3)

注：“-”抑菌圈直徑小于6 mm，判定無抑菌效果；“+”抑菌圈直徑6～10 mm，為低敏；“++”抑制圈直徑，為中敏.與無菌水比較，**P<0.01，差異極顯著；與體積分數(shù)75%乙醇比較，#P≤0.05，差異顯著；##P<0.01，差異極顯著.

無菌水空白對照的抑菌圈為0.00 mm，表明無外來污染的影響，無菌操作可控，實驗準確可信.設體積分數(shù)75%乙醇的對照，其對大腸桿菌的抑菌圈為(6.67±0.255) mm，而對金黃色葡萄球菌的抑菌圈(6.37±0.187) mm，說明體積分數(shù)75%乙醇對兩類供試細菌均具有一定的抑菌效果.試驗結果表明：與體積分數(shù)75%乙醇比較，桂花果皮醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈較大(8.98±0.413) mm，差異性達到顯著(P≤0.05)，而對大腸桿菌的抑菌圈更大(10.09±0.605) mm，差異極顯著(P<0.01).對G+和G-菌的抑制作用，桂花果皮醇提物的效果明顯高于體積分數(shù)75%的乙醇.

2.2比濁法測定的抑菌活性采用比濁法，測定桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結果見表2.

從表2可知，桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果均極顯著(P<0.01)，且隨桂花果皮醇提物質量濃度的增加，抑菌效果增強.與體積分數(shù)75%乙醇比較，桂花果皮醇提物有極顯著的差異性(P<0.01)，體積分數(shù)75%乙醇對大腸桿菌的抑菌率為2.55%，最低質量濃度125 mg/mL的桂花果皮醇提物的抑菌率達20.94%；而對金黃色葡萄球菌，體積分數(shù)75%乙醇的抑菌率為2.23%，最低質量濃度125 mg/mL桂花果皮醇提物的抑菌率達19.14%.因此，最低質量濃度125 mg/mL的桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率，明顯高于體積分數(shù)75%乙醇.桂花果皮醇提物質量濃度500 mg/mL時對大腸桿菌的抑菌率達到91.66%，而對金黃色葡萄球菌的抑菌率91.39%，桂花果皮醇提物對兩類細菌的抑制率均大于90%.

表2 桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率(n=3)

注：與空白對照比較，**P<0.01，差異極顯著；與乙醇比較##P<0.01，差異極顯著.

2.3桂花果皮醇提物的最低抑菌質量濃度(MIC) 采用試管二倍稀釋法，測定桂花果皮醇提物的MIC值，結果見表3.

表3 桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)(n=3)

注：“-”表示溶液清澈，無菌生長；“+”表示有少量細菌生長;“++”表示有較多細菌生長；“+++”表示溶液混濁，細菌正常生長，無抑菌效果.

結果表明：桂花果皮醇提物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌質量濃度為62.5 mg/mL，對大腸桿菌的最低抑菌質量濃度為125 mg/mL.結果提示，桂花果皮醇提物對G+菌的MIC值比對G-的MIC值小，可能對兩類細菌的抑制作用機理有差異.

2.4桂花果皮醇提物對DPPH·的清除活性用DPPH法測定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，評價其抗氧化活性，結果見圖1.

桂花果皮醇提物質量濃度(以生藥計)(mg/mL)

從圖1中，桂花果皮醇提物對DPPH·有明顯的清除能力，隨其質量濃度的增加，清除DPPH·的活性增強，表現(xiàn)出明顯的量效關系.桂花果皮醇提物質量濃度大于100 mg/mL，其清除DPPH·的活性達90%以上，趨于平緩.

在測定條件下，桂花果皮醇提物質量濃度與自由基清除率的擬合曲線方程為

y=27.215ln(x)-31.151，R2=0.938 2，

桂花果皮醇提物對DPPH·的IC50值為19.145 mg/mL.

2.5桂花果皮醇提物對ABTS·的清除活性用ABTS法測定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，從而評價其抗氧化活性，結果見圖2.

桂花果皮醇提物質量濃度(以生藥計)/(mg/mL)

從圖2可以看出：桂花果皮醇提物對ABTS·的清除能力顯著，隨其質量濃度的增加，對ABTS·的清除率明顯增強，表現(xiàn)出明顯的量效關系.當醇提物質量濃度達到50 mg/mL時，清除率高達95%，隨后質量濃度再增加，對ABTS·的清除率趨于平緩.

在測定條件下，桂花果皮醇提物質量濃度與其ABTS·清除率的擬合曲線方程為

y=7.727 5ln(x)-62.87，R2=0.955 3，桂花果皮醇提物對ABTS·的IC50值為4.624 mg/mL.

從桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的清除率、IC50值來看，抗氧化活性都很高，而且都表現(xiàn)出明顯的量效關系.

3 結論

桂花果皮用體積分數(shù)70%乙醇作為溶劑，制備得到醇提物，測定該醇提物的抑菌活性、抗氧化活性，為進一步研究桂花果皮的抑菌成分、抑菌機理等研究奠定了一定的基礎.

革蘭氏陰性的大腸桿菌、革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌是常見的食源性條件致病菌[22]，以抑菌圈、MIC為評價指標，采用濾紙片擴散法、比濁法和試管二倍稀釋法，測定桂花果皮醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果.濾紙片擴散法的結果表明，桂花果皮醇提物對G+和G-兩類細菌的抑菌效果，均達到顯著或極顯著；比濁法的結果表明，質量濃度500 mg/mL的桂花果皮醇提物，對G+和G-兩類細菌的抑制率都達到90%以上.桂花果皮醇提物對大腸桿菌的MIC值為125 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值為62.5 mg/mL.因此，桂花果皮醇提物具有顯著的抑菌活性.桂花果皮醇提物清除DPPH·的IC50值為 19.145 mg/mL，而清除ABTS·的IC50值為4.624 mg/mL，且都表現(xiàn)出明顯的量效關系，此結果表明，桂花果皮醇提物有明顯的抗氧化活性.

綜上所述，桂花果皮的醇提物具有一定的抑菌和抗氧化活性，作為未利用的植物副產(chǎn)物，桂花果皮有望開發(fā)成防腐劑或抗氧化劑，以期為桂花資源的高效利用提供理論參考.

致謝四川師范大學大精設備項目(DJ2016-08)、食品與藥品制造檢驗綜合應用的實踐、生物技術應用型人才培養(yǎng)綜合改革研究與實踐、四川師范大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201610636120)對本文給予了資助，謹致謝意.