趙云飛，邵澤香，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是一種磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphate，PLP）類酶，是生物合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的關(guān)鍵酶[1]。而GABA作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)[2]，不僅對于人體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、調(diào)節(jié)血壓、治療精神疾病、抗衰老等諸多方面發(fā)揮了重要作用[3-10]，而且能夠活化肝腎功能，促進生長激素的分泌，具有優(yōu)良的保健功能[11-15]，因而開發(fā)含有GABA的功能性保健品具有非常良好的經(jīng)濟前景。GAD分布廣泛，從單細胞有機體到高級哺乳動物有機體中均有GAD，但一般含量很低，無法大規(guī)模生產(chǎn)。而利用微生物來源的GAD催化L-谷氨酸鈉（L-sodium glutamate，L-MSG）生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，這使之成為生產(chǎn)GABA研究的熱點。但目前生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶GAD普遍只能在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用，在酶促反應(yīng)的過程中不斷消耗H＋導(dǎo)致pH值上升，但是由于在偏中性的條件下酶活性低、穩(wěn)定性差的缺點而難以應(yīng)用于生產(chǎn)。

為了提高GAD活性，通過蛋白質(zhì)工程手段對GAD進行酶分子水平的改造是常用的手段。進行蛋白質(zhì)工程改造主要是對酶分子進行理性設(shè)計和非理性設(shè)計（定向進化）等[16]。最新的研究中，Shi Feng等[17]為提高棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）Lb85表達的GAD在偏中性條件下的酶活性，通過易錯聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的條件得到突變株T17I、D294G，能夠大幅提高偏中性環(huán)境的酶活性；Lin Ling等[18]通過對短乳桿菌（Lactobacillus breris）編碼的GAD基因進行定向進化，得到突變株Q51H可以提高GAD最適pH值條件下的酶活性。但就目前而言，有關(guān)研究GAD分子改造方面的研究甚少，國內(nèi)外關(guān)于利用定向進化技術(shù)改造巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的相關(guān)研究尚鮮見報道。

本實驗室在前期對于GAD的研究中，從土壤中篩選到一株產(chǎn)GABA的菌株，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），其GAD基因為一段全新的序列，尚鮮見報道。然而該基因表達的GAD活性較低，極大地限制了其在工業(yè)上生產(chǎn)GABA的廣泛應(yīng)用。為了提高巨大芽孢桿菌GAD活性，本研究采用易錯PCR技術(shù)進行蛋白質(zhì)工程改造，以期可以獲得酶活性顯著提高的突變體，為GAD可以工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET30a（＋）-GAD重組質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶SacI與XhoI 大連寶生物公司；2×Taq PCR Mixture、卡納青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

5840R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；JY98-III超聲波細胞粉碎機 寧波新芝科學(xué)儀器研究所；PTC-100TMPCR儀美國MJ Research公司；PowPacTM高電流電泳儀美國Bio-Rad公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像儀上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 易錯PCR突變文庫的構(gòu)建

以pET30a（＋）-GAD重組質(zhì)粒為模板進行易錯PCR擴增，擴增引物為含有SacI酶切位點（下劃線）上游引物（5’-CGAGCTCATGCCTCAATGGCACCCG-3’）、含有XhoI酶切位點（下劃線）的下游引物（5’-GCTCGAG TTAATGATGAAATCCATTGTCGTATTTC-3’）。每50 μL反應(yīng)體系為：5 μL 10×易錯PCR緩沖液；14 μL Mg2＋（25 mmol/L）；4 μL dNTP（2.5 mmol/L dGTP、2.5 mmol/L dCTP、2.5 mmol/L dATP、2.5 mmol/L dTTP混合溶液）；1 μL上游引物（10 pmol/L）、1 μL下游引物（10 pmol/L）、3 μL MnCl2溶液（5 mmol/L）、1 μL質(zhì)粒模板、Taq DNA聚合酶5 U，最后加入高溫滅菌的超純水至總體積為50 μL。將第1輪易錯PCR的有益突變質(zhì)粒作為新1輪模板進行第2輪的易錯PCR。易錯PCR程序為95 ℃變性5 min后進行擴增循環(huán)，然后95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用DNA凝膠回收試劑盒進行純化。純化的易錯PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI、XhoI進行酶切。酶切后PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化回收，純化后的易錯PCR產(chǎn)物與同樣酶切處理后的pET-30a表達載體進行連接。連接后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建隨機誘變文庫。

1.3.2 突變體文庫的誘導(dǎo)表達

通過易錯PCR構(gòu)建的突變體文庫，采用96 微孔板法進行表達。參考Guo Fangfang等[19]建立的重組大腸桿菌產(chǎn)天冬酰胺酶的高通量篩選方法，過程稍作修改。篩選方法為：從LB-卡納青霉素平板上挑取單菌落，接種于96孔板，每孔含有500 μL LB（50 μg/mL卡納青霉素）培養(yǎng)基，以pET30a（＋）-GAD轉(zhuǎn)化子作為對照；37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，將50 μL菌液接種于另一含有600 μL LB（50 μg/mL卡納青霉素）培養(yǎng)基的96孔板中；37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至其OD600nm達到0.6～0.8，加入IPTG至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL；16 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。離心收集菌體，用150 μL質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL溶菌酶的磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7）重懸，37 ℃反應(yīng)30 min，然后反復(fù)凍融3 次以達到破碎細胞的目的，4 000 r/min離心10 min后，所得上清液即為粗酶液。

1.3.3 GAD突變體文庫的初篩

文庫篩選采用Yu Kai等[20]公開的高通量篩選方法，篩選在96 孔板內(nèi)進行，篩選過程作一定的修改以適應(yīng)實驗室條件的需要。在96 孔表達板中，每孔含有200 μL 50 mmol/L的醋酸緩沖液（包含的50 mmol/L溴甲酸紫、0.04 mmol/L的PLP，pH 5），然后向每孔加入10 μL 1 mmol/L的L-MSG磷酸鹽溶液（pH 5），混合均勻后，置于45 ℃保溫10 min，然后快速向每孔加入10 μL粗酶液，于45 ℃反應(yīng)15 min，觀察每孔內(nèi)顏色的變化。溴甲酚紫在pH 5.0～6.8的范圍內(nèi)，由黃色變?yōu)樽仙绻甘緞┑念伾牲S色變成紫色，則表示具有GAD活性，相同時間內(nèi)顏色變化越明顯表示酶活性越高。

1.3.4 酶的表達與純化

將初篩酶活性顯示提高的突變體接種于LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納青霉素）中培養(yǎng)至對數(shù)期，按照1%接種量接種于另一LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納青霉素）中，培養(yǎng)至其OD600nm值為0.6～0.8，加入IPTG（終質(zhì)量濃度為100 μg/mL），16 ℃誘導(dǎo)18 h左右。將培養(yǎng)好的菌體離心，棄掉上清液，用50 mmol/L的PBS（含0.5%的Triton 100，pH 7.0）重懸菌體，超聲破碎。破碎液離心取上清液即為粗酶液。重組pET30a-GAD表達過程中蛋白N端帶有組氨酸標(biāo)簽，因此使用鎳柱對野生型和突變型酶進行純化。蛋白純化之后采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度[21]，純酶使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測并進行酶學(xué)性質(zhì)的分析。

1.3.5 酶活性的測定

取10 μL純化后的酶液，加入到45℃預(yù)熱的490 μL底物溶液中（0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液，含0.04 mmol/L的PLP，100 mmol/L的L-MSG溶液，pH 5）。迅速混勻后在45 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速放入沸水浴終止反應(yīng)。采用高效液相色譜法測定反應(yīng)生成的GABA的含量，以測定突變酶的活力。在同樣條件下，以野生型GAD的反應(yīng)作為對照。酶活力單位：在測定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶定義為1 個酶活力單位（U）。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.6.1 酶促反應(yīng)的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

酶促反應(yīng)最適溫度測定：將純化后的酶液及底物溶液置于20～75 ℃范圍內(nèi)進行反應(yīng)測定酶活性。溫度穩(wěn)定性的測定：將酶液置于4～55 ℃溫度范圍內(nèi)處理12 h，以處理0 h酶活性作為100%，測定殘余酶活性。并且將酶液在55 ℃熱處理過程中間隔2 h取樣，測定野生型及突變酶的半衰期。每次反應(yīng)在相同條件下設(shè)置3 個平行，然后以平均值作為該條件下的酶活性。

1.3.6.2 酶促反應(yīng)的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

最適反應(yīng)pH值的測定：設(shè)置不同pH值范圍的底物溶液（pH 3～6），45 ℃反應(yīng)5 min測定酶活性。pH值穩(wěn)定性的測定：將酶液置于不同pH值范圍內(nèi)處理12 h（pH 3～7），測定殘余酶活性。

1.3.6.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線的測定

在不同濃度的底物溶液（L-MSG濃度5～100 mmol/L），加入過量的純酶液，最適條件下進行反應(yīng)，測定GAD的活性，通過Lineweaver-Burk作圖法計算Km和Kcat。

1.3.6.4 三維結(jié)構(gòu)模擬及分析

將野生型氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器模擬其三級結(jié)構(gòu)。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基之間的相互作用及突變位點對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.6.5 突變酶圓二色譜分析

將純化后的野生型和突變型酶液溶解于10 mmol/L PBS（pH7.0）中，在190～260 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描。以10 mmol/L PBS（pH 7.0）作為空白，分析野生型與突變型酶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理與圖像分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin軟件進行作圖分析，蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬需要提交到SWISS-MODEL進行模擬，三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果圖像采用PYMOL軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變文庫的高通量篩選結(jié)果

經(jīng)過兩輪易錯PCR，庫容量達到13 000以上，從結(jié)果上來看，有5 株突變體表現(xiàn)出比野生型更高的酶活性（表1）。并且得到酶活性最高的突變體A5-3，酶活性是野生型的3.10 倍，其中氨基酸突變2 個位點，分別為A55D、D451E。

表1 野生型酶和易錯PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 1 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR

將酶活性最高的突變體A5-3、E2-4、E3-11進行蛋白純化，得到其蛋白酶的比活力，結(jié)果見表2。

表2 野生型酶和易錯PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 2 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR

2.2 野生型酶與突變酶的純化結(jié)果

將野生型酶和突變酶表達純化后，通過SDS-PAGE分析（圖1），目的條帶均在50 kDa左右，與理論值53 kDa相符。

圖1 SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of wild-type and mutant enzymes

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

取10 μL重組酶與490 μL濃度為100 mmol/L的L-MSG混勻，在20～75 ℃反應(yīng)5 min，然后迅速放入沸水浴中10 min滅活終止反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。E3-11最適反應(yīng)溫度與野生型相同，均為45 ℃；而A5-3與E2-4最適反應(yīng)溫度為55 ℃，高于野生型。

圖2 野生型酶和突變酶最適反應(yīng)溫度Fig. 2 Effects of temperature on the activity of wild-type and mutant enzymes

將野生型酶與突變酶置于4～55 ℃保溫12 h測定殘余酶活性，以沒有處理組酶活性作為對照，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)溫度高于30 ℃后E2-4的殘余酶活性高于野生型，A5-3的殘余酶活性與野生型大致相當(dāng)，而E3-11則明顯低于野生型。并選擇55 ℃研究野生型及突變體的半衰期。

圖3 野生型酶和突變酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes

將野生型酶和突變體置于55 ℃保溫，每2 h進行取樣測殘余酶活性，測定野生型和突變體的半衰期。結(jié)果見表3。突變體A5-3與野生型溫度穩(wěn)定性無較大變化；E2-4的半衰期為21.92 h，高于野生型，說明穩(wěn)定性有所改善；而E3-11半衰期為10.81 h，低于野生型，說明E3-11的穩(wěn)定性有所下降。

表3 野生型酶和突變酶熱穩(wěn)定性Table 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes

2.3.2 酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

配制不同pH值的底物-緩沖液溶液（pH 2～6），測定在不同pH值條件下GAD的活性，結(jié)果如圖4所示。突變體E2-4與野生型的最適pH值相同，而A5-3與E3-11的最適pH值相較于野生型往中性pH值條件偏移，其中A5-3的最適pH值為5。但是在pH值大于5的條件下野生型與突變體的酶活性均急劇下降，尤其A5-3酶活性下降的最快，說明GAD為一種酸性酶，H＋的濃度嚴重影響酶活性。

圖4 野生型酶與突變酶的最適反應(yīng)pH值Fig. 4 Effects of pH on the activity of wild-type and mutant enzymes

野生型酶與突變酶在不同pH值緩沖液（pH 3～7）的條件下保存12 h，測定殘余酶活性，相對酶活性如圖5所示。相較于野生型，突變體A5-3、E2-4、E3-11在pH值大于4.5的條件下具有更好的pH值穩(wěn)定性。表明在偏中性的條件下，突變體更容易得到應(yīng)用，能夠承受偏中性條件的發(fā)酵環(huán)境。

圖5 野生型酶和突變酶pH值穩(wěn)定性Fig. 5 pH stability of wild-type and mutant enzymes

2.3.3 酶的動力學(xué)參數(shù)

表4 野生型酶與突變酶的動力學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic parameters of wild-type and mutant enzymes

如表4所示，突變體A5-3、E2-4的Km值相較于野生型均略有下降，E3-11的Km值略高于野生型，但大致相同，說明酶對底物的親和力并沒有太大變化；突變酶的Kcat/Km值都高于野生型，表明其催化活力有所提高。

2.3.4 三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果及分析

為探明E2-4、A5-3、E3-11酶活性提高的原因，構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，從氨基酸殘基之間的相互作用及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變進行解析。目前微生物來源的GAD，只有源于大腸桿菌的GAD得到了晶體解析。而源于巨大芽孢桿菌的GAD三維結(jié)構(gòu)尚未解析，所以將野生型的基因序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器中，通過對PDB庫內(nèi)現(xiàn)有的GAD三維結(jié)構(gòu)進行模擬（圖6A、B），相似度達到70%以上。巨大芽孢桿菌酶活性中心位點為279位的Lys，位于GAD內(nèi)部的無規(guī)則卷曲處，此位點結(jié)合PLP進行催化反應(yīng)；同時88位Asp直接參與催化反應(yīng)，為反應(yīng)提供必需的H＋，因此該位點嚴格保守。突變體主要的突變位點在55位的Ala、34位的Leu、325位的Ala，位點突變后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化見圖6C～F。由圖6可知，34位的Leu位于蛋白結(jié)構(gòu)的一段無規(guī)則卷曲處，突變成Gln后酰胺鍵的存在一定程度上加強了這一部位的剛性，一定程度上提高了其穩(wěn)定性，而且34位的Leu位于蛋白結(jié)構(gòu)的表面，突變成親水的Gln使結(jié)構(gòu)變得更加合理；第55位的Ala位于GAD的一條α-螺旋臂上，并且遠離活性中心，突變成了Asp之后，Asp不僅可以極大地增強供H＋能力，而且可以形成氫鍵，很可能與51位的His形成了氫鍵，進而改變附近無規(guī)則卷曲的柔性，且His擁有儲存H＋能力，一旦催化反應(yīng)消耗掉H＋可以得到快速的補充，從而加快了酶的催化反應(yīng)；325位的Ala位于內(nèi)部的一條α-螺旋臂上，遠離活性中心，突變成Ser，雖然一定程度上提高了催化反應(yīng)，但是很可能增加了酶的柔性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶本身的穩(wěn)定性下降。

圖6 巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶三維結(jié)構(gòu)建模Fig. 6 3D protein structure models of GAD from Bacillus megaterium

2.3.5 突變酶的圓二色譜分析

表5 突變酶二級結(jié)構(gòu)的比例Table 5 Proportions of secondary structures in mutant enzymes

在圓二色譜儀中190～260 nm波長范圍內(nèi)測定蛋白質(zhì)的橢圓率[22]，對突變酶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量進行分析。由表5可知，與野生型相比，3 個突變體的二級結(jié)構(gòu)含量變化不大，E2-4的α-螺旋含量略有增加，說明溫度穩(wěn)定性所有提高；A5-3、E2-4、E3-11的無規(guī)則卷曲均有增加。研究表明，無規(guī)則卷曲的增加提高了蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)，不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[23-25]，而α-螺旋能夠維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[26]，這在一定程度上解釋了熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果。

3 討 論

目前有關(guān)來源于微生物的GAD的研究，主要集中于新基因的挖掘以及針對酶催化活性的分子改造。研究者經(jīng)過研究，進一步闡述了GAD的作用機制，其中N端序列的氨基酸主要與GAD的空間分布有關(guān)，研究者[27-28]通過設(shè)計N端缺失體與野生型比較，發(fā)現(xiàn)在酸性pH值中N端缺失體在胞質(zhì)內(nèi)的分布有了顯著提高。但這一部分的研究仍然不是十分明確，例如Shi Feng等[17]的研究源于谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的GAD發(fā)現(xiàn)突變株T17I仍然能夠顯著提高酶活性，并且擴展GAD有效的pH值范圍；另外在第300位左右的氨基酸殘基會形成一個β發(fā)夾環(huán)，這個區(qū)域在不同pH值條件下會有不同的構(gòu)象，對酶促反應(yīng)起到了“開關(guān)”作用，在中性pH值條件下，β發(fā)夾環(huán)與C端區(qū)域的幾個氨基酸殘基相互作用，改變了活性中心的構(gòu)象，嚴重影響了酶促反應(yīng)。而且在中性pH值條件下，PLP也很容易與活性位點解離，C末端延伸到活性中心并與活性位點結(jié)合，擋住底物入口，阻止底物與活性位點結(jié)合，極大地降低了酶活性[20]。因此有研究者[20]通過替換β環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)、C末端結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸殘基擴展GAD在偏中性條件下的酶活性，收到了很好的效果，但仍存在很大的局限性。Yu Kai等[20]對源于Lactobacillus breris的GAD活性中心研究闡明，Phe65與Thr215形成了疏水的底物入口，PLP與活性中心Lys279的形成共價的希夫堿結(jié)構(gòu)；Asp88、Asp248是活性中心高度保守的殘基，在催化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用；另外，His278、Ser127以及PLP磷酸基團附近的螺旋在維持的位置和正確取向方面也有著重要的意義。在更多有關(guān)GAD分子改造方面的研究也主要集中于提高GAD在偏中性條件下的酶活性，如Shi Feng等[17]研究得到的突變株E312S能夠極大地改善偏中性條件下的酶活性，但是仍然存在酶活性低、穩(wěn)定性差、難以得到實際應(yīng)用的缺點。

本研究在實驗室發(fā)掘到來源于巨大芽孢桿菌新的GAD基因的基礎(chǔ)上，運用易錯PCR策略對GAD基因進行改造，從13 000 多個突變株中得到了3 株酶活性提高的菌株A5-3、E2-4、E3-11，突變酶的比活力比野生型分別提高了157%、115%、97%，最優(yōu)突變體A5-3酶比活力達到（143.27±1.28）U/mg，且動力學(xué)研究表明，突變位點對酶的Km影響較小，但對Kcat影響較大，突變酶A5-3的Kcat/Km為17.29 L/（mmol·s），較野生型提高了152%，說明該突變酶的催化活性大幅提高，該結(jié)果優(yōu)于Shi Feng[17]、Lin Ling等[18]定向進化后突變酶的催化效率。

為了探明突變酶活性提高的原因，將野生型的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL，得其三維結(jié)構(gòu)。突變體A5-3在55位發(fā)生了突變，此位點由Ala突變成Asp，由三維結(jié)構(gòu)模擬可知，此位點位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的α-螺旋上，離活性中心較遠。GAD作為一種酸性酶，反應(yīng)中H＋是必需的底物，但是在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，由于反應(yīng)不斷消耗掉H＋，因而始終處于缺H＋的狀態(tài)。Asp作為一種酸性氨基酸，其等電點為pH 2.77，在pH值大于2.77的條件下以質(zhì)子化的形式存在，偏酸性條件下就可以解離出H＋，參與酸堿催化反應(yīng)，且側(cè)鏈短，親水性強，易形成氫鍵[29]，很可能與51位的His形成氫鍵，進而影響周圍的結(jié)構(gòu)，且His擁有儲存H＋能力，His的pKa值接近生理pH值，所以蛋白內(nèi)的組氨酸一般都是保守的。Asp55與His51的這種聯(lián)系很可能形成了一種供H＋“通道”，一旦催化反應(yīng)消耗掉H＋就可以得到快速補充，從而加快酶的催化反應(yīng)。將此位點定點突變成同為酸性氨基酸的Glu，亦得到了酶活性提高的突變體，說明該位點確實與酶促反應(yīng)中H＋的供應(yīng)有關(guān)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)角度看，疏水相互作用主要是影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中的最重要因素[30]，有研究者通過系統(tǒng)分析22 個蛋白質(zhì)中和疏水相互作用有關(guān)的148 個突變體發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻約為（60±4）%，而氫鍵對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻約為（40±4）%，這表明疏水相互作用是蛋白質(zhì)折疊過程中最重要的驅(qū)動力[31-32]。突變體E2-4在34位由Leu突變成Gln，由模擬結(jié)果可知，此位點位于N端區(qū)域，這一區(qū)域是一段無規(guī)則卷曲，構(gòu)象極具柔性，目前的研究結(jié)構(gòu)顯示N端區(qū)域主要與GAD在胞質(zhì)中的分布有關(guān)，但是對于其全部生理功能雖然尚不明確，但對于蛋白質(zhì)亦不可或缺。34位的Leu位于蛋白六聚體的表面，Leu是疏水性氨基酸，位于蛋白結(jié)構(gòu)表面，不利于蛋白質(zhì)表面形成水化膜以保護蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而Gln側(cè)鏈是親水基團，有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，且側(cè)鏈酰胺基團的存在可以與附近的氨基酸殘基形成氫鍵，一定程度上限制了周圍無規(guī)則卷曲的柔性結(jié)構(gòu)，因而34位的Leu突變成Gln致使突變酶的溫度穩(wěn)定性略有提高。圓二色譜結(jié)果表明，突變酶E2-4的α-螺旋增加，表明其溫度穩(wěn)定性有所改善，而E3-11的α-螺旋數(shù)減少，無規(guī)則卷曲增加，表明其柔性增加，有利于酶與輔酶、底物的結(jié)合與釋放，蛋白結(jié)構(gòu)柔性含量增加可能是3 個突變體酶活性提高的原因，但同時無規(guī)則卷曲的增加也使突變酶剛性結(jié)構(gòu)減少，不利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與熱穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。

通過定向進化技術(shù)提高巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的酶催化活性，提高該酶應(yīng)用于工業(yè)的潛在價值，也為GAD分子改造方面提供更多參考，利于后續(xù)有關(guān)GAD的研究。也說明通過定向進化技術(shù)可以顯著提高巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的催化活性。