呂曉倩，王靜雪*，林 洪

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，是一種重要的病原菌，不僅能夠引起人的化膿性疾病，同時也會引起食源性疾病[1-3]。近年來由于抗生素的濫用引發(fā)的多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給金黃色葡萄球菌的控制帶來了極大的困難[4-5]。而噬菌體內(nèi)溶素卻可以很好地解決這一問題，噬菌體內(nèi)溶素為噬菌體侵染宿主后期釋放的一種能夠特異性裂解細胞壁肽聚糖的蛋白[6-7]。已有研究表明內(nèi)溶素能夠有效抑制肺炎雙球菌、炭疽芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯菌、單核細胞性李斯特菌和沙門菌等多種病原菌[8-12]。

目前，獲得內(nèi)溶素的方法有兩種，一種是物理提取法[13]，一種是克隆表達法[14-15]。物理提取法適用于任何噬菌體，但此法獲得的酶液成分復(fù)雜，酶活穩(wěn)定性較差，得率也相對較低，因此，此方法使用率低，通常制備內(nèi)溶素時，大多采用的是克隆表達法?？寺”磉_法適用于有明確基因序列且基因序列功能明確為內(nèi)溶素的噬菌體[16]?？寺”磉_的難點在于保證重組蛋白的成功表達同時還要保證酶的活性。

在前期工作中，本實驗室分離得到一株烈性金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001[17]，并對其進行全基因組測序，基于相似性分析推測開放式閱讀框56（ORF56）編碼的蛋白為本株噬菌體的內(nèi)溶素。本實驗首先通過多種在線軟件對ORF56編碼內(nèi)溶素的各項特性進行分析[18]，然后選擇用克隆表達的方法獲得該內(nèi)溶素[19-20]，為下一步內(nèi)溶素裂解特性及應(yīng)用的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噬菌體為本實驗室分離保存的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001，保存號為CCTCCM 2015553；金黃色葡萄球菌ATCC6538 美國典型微生物菌種保藏中心；感受態(tài)大腸桿菌TOP10、Rosetta（DE3） 上海生工生物工程股份有限公司；pET-30a質(zhì)粒 德國Novagen公司。

LB肉湯、LB瓊脂、TSB 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；液體、固體培養(yǎng)基均由成品制劑與純水按規(guī)定比例配制而成；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、咪唑索萊寶生物技術(shù)有限公司；SK3071非干擾型蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒、Ni-IDA填料 上海生工生物工程股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、T4連接酶 大連Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；JY88-II超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽北京六一儀器廠；Power Wave XS型酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)溶素特性預(yù)測

1.3.1.1 內(nèi)溶素基因的同源性分析

利用國際生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的局域相似性比對工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），采用氨基酸序列比對，對ORF56編碼的氨基酸序列進行檢索比對。

1.3.1.2 內(nèi)溶素理化特征預(yù)測

利用ExPASy Bioinformatics Resource Portal（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）對內(nèi)溶素的分子質(zhì)量、等電點、氨基酸組成等理化特征進行預(yù)測。

1.3.1.3 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測

采用SMART軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）、InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）和NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對內(nèi)溶素的模塊化結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.3.1.4 內(nèi)溶素信號肽序列預(yù)測

利用SignalP 4.1服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測內(nèi)溶素是否含有信號肽。

1.3.1.5 內(nèi)溶素跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和TMHMM v2.0服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對內(nèi)溶素進行跨膜區(qū)的預(yù)測。結(jié)合ProtScale程序（http://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測蛋白質(zhì)疏水性，輔助判斷跨膜區(qū)預(yù)測的正確性。

1.3.2 內(nèi)溶素基因的合成與表達載體的構(gòu)建

1.3.2.1 內(nèi)溶素基因的合成

根據(jù)內(nèi)溶素基因序列設(shè)計42 條引物（表1），通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增出足夠量的目的基因產(chǎn)物。引物設(shè)計及序列合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 內(nèi)溶素基因擴增所需引物Table 1 Primer sequences used for amplification of target gene

續(xù)表1

1.3.2.2 表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將合成的目的基因純化后用NdeI與XhoI雙酶切，膠回收雙酶切產(chǎn)物，與同樣經(jīng)雙酶切的載體pET-30a連接；利用熱擊法將重組后的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上；挑選陽性克隆單菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI與XhoI雙酶切鑒定正確后，送至上海生工生物工程有限公司測序。

取1 μL重組pET-30a-lys56質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）表達菌株，42 ℃熱擊90 s，冰上靜置2 min后涂平板（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素），37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。

1.3.3 重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件的確定

挑取表達菌株的單菌落于LB培養(yǎng)基（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素）試管中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于LB培養(yǎng)基中（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素），37 ℃、220 r/min培養(yǎng)約3 h。當(dāng)OD600nm值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min條件下分別20 ℃誘導(dǎo)過夜；37 ℃誘導(dǎo)4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對照。4 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清液，菌體用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（NaCl 8 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.17 g，KCl 0.2 g，配制1 L PBS，pH 7.4）懸浮后，進行超聲破碎，分別離心收集上清液和沉淀，沉淀用包涵體溶解液（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0）溶解，對上清液和復(fù)融沉淀分別進行SDS-PAGE檢測。

1.3.4 重組蛋白的純化及檢測

將5 mL Ni-IDA填料裝入柱子中，以5 mL/min的流速用10 倍柱床體積的Binding Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）清洗平衡柱子直至基線平穩(wěn)；以2 mL/min的流速上樣并收集穿透液；再以10 mL/min的流速用10 倍柱床體積的Binding Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）清洗柱子后，用Wash Buffer I（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）和Wash Buffer II（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Imidazole，pH 8.0）分別以5 mL/min的流速洗脫雜蛋白，最終用Elution Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole，pH 8.0）洗脫目的蛋白。將純化好的目的蛋白透析到蛋白保存液（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）中，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，-80 ℃保存，并進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.3.5 重組蛋白質(zhì)量濃度的測定

利用SK3071非干擾型蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒對純化好的蛋白質(zhì)量濃度進行測定。以吸光度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)牛血清白蛋白量為橫坐標(biāo)，用Microsoft Excel軟件繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式；將測得的待定量蛋白質(zhì)樣品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計算出所對應(yīng)的蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)溶素特性預(yù)測結(jié)果

2.1.1 內(nèi)溶素同源性分析

利用BLAST中氨基酸序列比對工具BLASTP對噬菌體qdsa001中的內(nèi)溶素基因編碼的氨基酸進行檢索，在公共檢索數(shù)據(jù)庫中有4 個同源性非常高的同源蛋白（表2），其中有2 個均為N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，屬于內(nèi)溶素，并且比對結(jié)果E值均不大于0，可信度較高。由此可以斷定ORF56編碼的蛋白為噬菌體qdsa001的內(nèi)溶素，并命名為lys56。

表2 噬菌體qdsa001內(nèi)溶素BLAST結(jié)果Table 2 Sequence analysis of endolysin-encoding gene of bacteriophage qdsa001 using BLAST

2.1.2 內(nèi)溶素理化特征預(yù)測結(jié)果

利用ExPAsy Bioinformatics Resource Portal預(yù)測內(nèi)溶素的分子質(zhì)量為35.1 kDa，等電點為8.97，氨基酸組成見表3。

表3 氨基酸組成Table 3 Amino acid composition

2.1.3 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

利用3 個不同的軟件對內(nèi)溶素的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測后顯示，內(nèi)溶素中僅存在一個結(jié)構(gòu)域Ami_2，范圍在18～162 個氨基酸（圖1）。

圖1 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 1 Prediction of structural domain of endolysin

2.1.4 內(nèi)溶素信號肽預(yù)測結(jié)果

利用SignalP 4.1對內(nèi)溶素信號肽進行預(yù)測。信號肽剪切位點預(yù)測通過Y最大值來判斷；是否為分泌蛋白通過S平均值來判斷，若S大于0.5，則預(yù)測為分泌蛋白，存在信號肽。結(jié)果顯示內(nèi)溶素不含有信號肽。

圖2 內(nèi)溶素信號肽預(yù)測Fig. 2 Prediction of signal peptide of endolysin

2.1.5 內(nèi)溶素跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

一般蛋白折疊時會在潛在的跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)域，而TMHMM Server v.2.0和TMpred（一般分值大于1 500代表預(yù)測為跨膜螺旋區(qū)）都未預(yù)測到跨膜結(jié)構(gòu)（圖3A、C），ProtScale（負值越大表示親水性越好，正值越大表示疏水性越好）進行了疏水性預(yù)測，也未預(yù)測到疏水性區(qū)域（圖3B），兩個預(yù)測結(jié)果相一致。因此，此內(nèi)溶素中并無跨膜結(jié)構(gòu)存在。

圖3 內(nèi)溶素基因編碼蛋白跨膜區(qū)以及疏水性預(yù)測Fig. 3 Prediction of transmembrane helices and hydrophobicity of endolysin

2.2 內(nèi)溶素的克隆表達及純化

2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

由上海生工生物工程有限公司合成的目的基因，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖4），在1 000 bp左右有一清晰條帶，與預(yù)期的片段大小918 bp相符合（泳道2）。將內(nèi)溶素基因與原核表達載體pET-30a相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-lys56。利用NdeI與XhoI雙酶切重組質(zhì)?？梢郧谐鲱A(yù)期大小的片段（泳道3）。對重組質(zhì)粒進行核苷酸測序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的插入序列與內(nèi)溶素目的基因一致。

圖4 合成的目的基因及重組質(zhì)粒雙酶切后電泳圖Fig. 4 Target gene and recombinant plasmid double digested by NdeI and XhoI

2.2.2 最佳誘導(dǎo)條件的確定

圖5 重組蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5 Endolysin expression detected by SDS-PAGE

由圖5可見，經(jīng)20 ℃過夜和37 ℃、4 h的條件誘導(dǎo)后，上清液和沉淀中在35.0 kDa處均有明顯的蛋白條帶，最終選擇20 ℃過夜誘導(dǎo)作為誘導(dǎo)表達的最佳條件。

2.2.3 目的蛋白純化及檢測結(jié)果

將表達菌株在最佳誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)后，超聲裂菌并離心收集上清液，利用鎳瓊脂糖親和層析對目的蛋白進行純化。將上清液直接通過Ni-IDA層析介質(zhì)，用不同濃度的咪唑洗脫，收集不同過程中流出的液體，并對其進行SDS-PAGE分析。由圖6可見，咪唑濃度為20 mmol/L和50 mmol/L時，洗脫出大量雜蛋白，當(dāng)咪唑濃度為500 mmol/L時，有大量的目的蛋白被洗脫。

圖6 鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE圖Fig. 6 Purification of recombinant endolysin by Ni-IDA affinity chromatography

圖7 純化目的蛋白SDS-PAGE（A）及Western Blot免疫印跡（B）圖Fig. 7 SDS-PAGE (A) and Western Blot (B) analysis of purified recombinant protein

將得到的高純度目的蛋白進行最終的SDS-PAGE及Western Blot檢測，最終確定內(nèi)溶素lys56表達成功（圖7）。

2.2.4 目的蛋白質(zhì)量濃度測定結(jié)果

蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-0.005 4x＋0.980 1，R2=0.995 4。通過計算得到目的蛋白質(zhì)量濃度為5.77 mg/mL。

3 討 論

與噬菌體相比，內(nèi)溶素在應(yīng)用上具有眾多優(yōu)勢，尤其是其成分僅為蛋白質(zhì)，因而在食品的應(yīng)用中安全性更具有保障[21-23]。

基于基因序列的分析通常是利用各種生物學(xué)軟件通過與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息的相似性比對，從而快速了解未知基因的功能，并對其編碼蛋白進行功能和結(jié)構(gòu)的預(yù)測[24-26]。本實驗利用多種在線軟件對內(nèi)溶素的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜域和結(jié)構(gòu)域等多個特性進行分析，結(jié)果顯示內(nèi)溶素lys56分子質(zhì)量為35.1 kDa，等電點為8.97，無信號肽和跨膜域，僅擁有一個結(jié)構(gòu)域Ami_2。

內(nèi)溶素lys56因其編碼基因為已知因素，故而選擇克隆表達的方法獲得內(nèi)溶素。大腸桿菌表達系統(tǒng)是開發(fā)最早、技術(shù)最成熟的異源蛋白原核表達系統(tǒng)；pET系列質(zhì)粒因其克隆表達融合蛋白的高效性以及帶有多種可選擇的融合標(biāo)簽，是目前應(yīng)用最廣泛的原核表達載體系統(tǒng)[27-28]。pET-30a質(zhì)粒含有組氨酸標(biāo)簽，通常來說，組氨酸標(biāo)簽肽段相對親水，不會對蛋白的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此在通常情況下含有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白仍然能表現(xiàn)出完全的活性[29]，并且也可以大大地簡化后續(xù)的純化步驟[30-31]。本實驗選擇大腸桿菌TOP10為表達宿主菌，pET系列中的pET-30a質(zhì)粒為表達載體，將合成的目的基因插入原核表達載體pET-30a中，成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-lys56，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，獲得了表達穩(wěn)定的基因工程菌，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于20 ℃過夜誘導(dǎo)，獲得較高量目的蛋白的上清液表達。

總之，本研究通過生物信息學(xué)的方法快速分析了內(nèi)溶素的各項特性并成功地表達了金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001的內(nèi)溶素lys56，為其裂解特性、裂解機制的探究以及應(yīng)用提供了理論支持。