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        強烈熾熱球菌幾丁質(zhì)酶水解制備低脫乙酰度殼寡糖及其組成與結(jié)構(gòu)分析

        2018-10-08 02:50:12焦思明任立世康躋耀杜昱光
        食品科學 2018年18期
        關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)寡糖乙酰

        程 功,焦思明,任立世,馮 翠,康躋耀,杜昱光*

        (中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

        殼寡糖是由氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖或者二者的組合通過β-1,4糖苷鍵連接形成的寡聚物,聚合度小于20,相對分子質(zhì)量小于3 900;通常由甲殼素或者其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖經(jīng)過酸水解、物理水解或酶解等方法獲得[1]。殼寡糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及誘導植物抗病抗逆與促進植物生長等生物活性[2-6]。與動植物及人體中的特定受體結(jié)合是殼寡糖發(fā)揮上述生物活性的重要方式。目前,已有多種可與殼寡糖特異性結(jié)合的受體被發(fā)現(xiàn)。比如,殼寡糖可與甘露糖受體特異性結(jié)合并激活巨噬細胞,其中,N-乙酰氨基葡萄糖在殼寡糖與甘露糖受體結(jié)合過程中發(fā)揮決定性作用[7-8]。在人體中還存在多種幾丁質(zhì)凝集素,如YKL-39及YKL-40等,在炎癥發(fā)生、細胞增殖及自身免疫性疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,均已被證實具有殼寡糖結(jié)合活性,且N-乙酰氨基葡萄糖在其中也起到?jīng)Q定性作用[9-11]。在植物中,已經(jīng)鑒定出多種可與殼寡糖特異性結(jié)合的受體,如水稻幾丁質(zhì)受體OsCEBiP及幾丁質(zhì)和肽聚糖的共受體OsLYP4/OsLYP6等[12-15]。這些植物受體的共同特征是都具有可專一識別N-乙酰氨基葡萄糖的LysM結(jié)構(gòu),進一步說明該單糖組分在該類型配體受體識別過程中的決定性作用[16-17]。

        在工業(yè)上,通常將甲殼素經(jīng)堿法脫乙酰獲得殼聚糖,再經(jīng)過酶法水解獲得殼寡糖[18-19]。由于使用的化學脫乙酰過程為非勻相反應過程,僅能獲得脫乙酰度大于85%的酸溶殼聚糖,以其為原料進一步水解獲得的殼寡糖脫乙酰度也大于85%。由于這些商品殼寡糖中所含的N-乙酰氨基葡萄糖組分已經(jīng)較少,與專一性識別該單糖組分的特定受體的結(jié)合能力也相應較低,難以充分發(fā)揮其生物活性。因此,以低脫乙酰度(如脫乙酰度小于70%)殼聚糖為底物,通過酶解制備獲得富含N-乙酰氨基葡萄糖的殼寡糖,可能最大程度發(fā)揮其生物活性。目前,殼寡糖的活性及功能研究主要還是集中在高脫乙酰殼寡糖,低脫乙酰度殼寡糖的制備及功能研究仍然十分缺乏。

        傳統(tǒng)方法制備的高脫乙酰度殼聚糖,因乙?;淮蟛糠置摮挥袣ぞ厶敲覆拍軐ζ溥M行較徹底水解以制備獲得殼寡糖。而低脫乙酰度殼聚糖,因保留較多N-乙酰氨基葡萄糖組分,除殼聚糖酶外,廣泛存在于動植物及微生物中的幾丁質(zhì)酶也可對其較充分水解,從而可以用于制備具有新的結(jié)構(gòu)特征的殼寡糖。多種商品酶,如纖維素酶、蛋白酶及脂肪酶等,因其中具有降解殼聚糖活性酶類,已被報道用于殼寡糖的制備,具有容易獲得且可規(guī)?;椒ǖ葍?yōu)勢[20-24]。然而,這些粗酶中降解殼聚糖的活性酶類的具體蛋白組分仍不清晰,而且一些微生物發(fā)酵來源的商品酶中可能同時帶有多種殼聚糖酶及幾丁質(zhì)酶,其降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)較為復雜,給后續(xù)組分分離及構(gòu)效關(guān)系研究帶來困難。而利用表達的專一性殼聚糖水解酶類水解低脫乙酰度殼寡糖則可以獲得結(jié)構(gòu)可控的殼寡糖。

        在殼寡糖規(guī)模制備過程中,所用水解酶的耐高溫性能十分重要。在前期研究中,Oku等[25]發(fā)現(xiàn)來源于強烈熾熱球菌的幾丁質(zhì)酶同時具有兩個水解活性結(jié)構(gòu)域,且結(jié)構(gòu)域2單獨使用時具有最高的幾丁質(zhì)酶水解活性。該研究使用的底物為甲殼素,并沒有對該酶水解低脫乙酰度殼聚糖的能力及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特性進行鑒定。因此,本研究進一步確定其降解低脫乙酰殼聚糖的能力并對其水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行鑒定,可以為低脫乙酰度殼寡糖的規(guī)模制備及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究提供理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        表達載體pET28a為本實驗室保存;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞Escherichia coli DH5α及BL21 寶日醫(yī)(北京)生物技術(shù)有限公司;甲殼素(來源于蝦殼;貨號:900332) 美國Sigma-Aldrich公司;內(nèi)切酶NdeI及BamHI、蛋白Marker(貨號:26617)、乙腈(色譜純) 美國Thermo Fisher公司;混合多肽標準樣品、2,5-二羥基苯甲酸(貨號:201346)德國Bruker公司;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設備

        Autoflex III smartbeam型基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)儀 德國Bruker公司;AVANCE III 600MHz核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)儀 瑞士Bruker公司;TSK GEL4000PWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm) 日本Tosoh公司;高效液相色譜儀(配備可變波長紫外檢測器及蒸發(fā)光檢測器和色譜工作站) 華譜科儀(北京)科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 強烈熾熱球菌幾丁質(zhì)酶基因全合成、克隆及表達

        在本研究中,選擇強烈熾熱球菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域2(NCBI Reference Sequence: WP_011012376.1, 258-717)的編碼核酸序列進行全基因合成(委托上海生工生物工程有限公司完成),并在合成前在5’及3’末端分別添加NdeI及BamHI酶切位點以利于后續(xù)表達載體構(gòu)建。使用NdeI及BamHI對合成的含有目的基因片段的質(zhì)粒pUC57及表達載體pET28a進行雙酶切,分別回收目的片段及表達載體,使用T4連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α。提取重組載體質(zhì)粒并使用上述雙酶切方法獲得正確的重組克隆,轉(zhuǎn)化至E. coli BL21中在16 ℃條件下使用異丙基硫代半乳糖苷誘導24 h。離心回收菌體并對其進行超聲破碎,進一步離心獲得上清液,使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)查看蛋白表達情況。

        1.3.2 低脫乙酰殼寡糖制備

        低脫乙酰度殼聚糖的制備參考Kurita等[26]的方法。脫乙酰度測定使用1H NMR,具體方法為:稱取5 mg制備的殼聚糖,加入0.5 mL超純水及0.25 μL濃鹽酸,充分溶解后凍干,凍干樣品加入0.5 mL D2O,待其充分溶解后加樣檢測。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4鈉鹽為內(nèi)標,參考Lavertu等[27]的方法計算其脫乙酰度。稱取1 g制備的部分脫乙酰殼聚糖,加入100 mL超純水及0.35 mL濃鹽酸,充分溶解后加入100 μL幾丁質(zhì)酶誘導上清液,85 ℃攪拌反應24 h。反應結(jié)束后離心去沉淀,上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凍干,用于后續(xù)分析。

        1.3.3 低脫乙酰度殼寡糖分子排阻高效液相色譜(size exclusion high performance liquid chromatography,SEHPLC)分析

        稱取10 mg殼寡糖樣品,溶解于1 mL超純水中,配成10 mg/mL殼寡糖溶液。具體分析方法為:使用TSK GEL4000PWXL凝膠色譜柱進行相對分子質(zhì)量分布分析,以相對分子質(zhì)量1 000、5 000及25 000的葡聚糖為對照,進樣量10 μL,流動相0.1 mol/L的甲酸銨(pH 3.2);檢測器溫度50 ℃;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;進樣量20 μL,蒸發(fā)光檢測器進行檢測。

        1.3.4 低脫乙酰度殼寡糖MALDI-TOF MS分析

        吸取7 μL三氟乙酸于7 mL超純水中,配制成體積分數(shù)0.1%三氟乙酸溶液,再加入3 mL乙腈混勻,記為TA30溶液備用。稱取20 mg的基質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸,溶解于1 mL的TA30溶液中,配制成20 mg/mL基質(zhì)溶液。稱取10 mg殼寡糖樣品,溶解于5 mL TA30溶液中,配成2 mg/mL殼寡糖溶液。吸取殼寡糖溶液1 μL于樣品靶上,待其自然干燥后再點上1 μL基質(zhì)溶液,充分干燥。檢測樣品前先使用混合多肽標準樣品對相對分子質(zhì)量進行校準。樣品靶放入MALDI-TOF MS后,使用正離子反射模式進行檢測。

        1.3.5 低脫乙酰度殼寡糖NMR分析

        使用1H NMR及13C NMR分別對酶解制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成進行分析,具體方法為:稱取25 mg制備的殼寡糖凍干樣品,加入0.50 mL D2O,待其充分溶解后加樣檢測。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4鈉鹽為內(nèi)標,使用AVANCE III 600 MHz NMR儀對樣品進行檢測,其中,1H NMR檢測時對水峰進行抑制以減少其干擾。獲得的原始數(shù)據(jù)使用核磁分析軟件MestReNova打開后,使用內(nèi)標校正位移值,參考Sasaki等[28]的方法對特定部位單糖進行標記,具體的參考位移值包括1H NMR中的還原端氨基葡萄糖(-D,δ 5.19)、還原端N-乙酰氨基葡萄糖(-A,δ 5.43)、還原端兩個連續(xù)N-乙酰氨基葡萄糖(-AA,δ 4.70)以及13C NMR中5位碳(C5)的非還原端氨基葡萄糖(D-,δ 79.0)、非還原端N-乙酰氨基葡萄糖(A-,δ 78.5)等。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 強烈熾熱球菌幾丁質(zhì)酶基因全合成、克隆及原核表達

        將全基因合成的幾丁質(zhì)酶基因(記為chiB)克隆至表達載體pET28a中,挑取3 個克隆菌落提取質(zhì)粒及雙酶切電泳結(jié)果顯示,酶切產(chǎn)物E1及E2獲得了預期大?。? 395 bp)的片段,而酶切產(chǎn)物E3中沒有出現(xiàn)預期大小片段,說明為假陽性(圖1A)。E1原始質(zhì)粒的雙末端測序結(jié)果確認目的基因被正確插入表達載體中。將E1原始質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21中,對誘導表達產(chǎn)物P及其誘導前對照C進行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示,誘導后在40~55 kDa的位置出現(xiàn)了一個新的蛋白條帶,與chiB編碼的蛋白(記為CHIB)的理論分子質(zhì)量50.6 kDa相符(圖1B)。

        圖1 幾丁質(zhì)酶基因chiB重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物(A)及其蛋白表達產(chǎn)物(B)電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis maps of restriction enzyme hydrolysates recombinant plasmid harboring chiB gene (A) and protein expression products (B)

        2.2 幾丁質(zhì)酶CHIB水解制備低脫乙酰度殼寡糖及組分鑒定

        為證實誘導表達的幾丁質(zhì)酶具有殼聚糖降解活性,以制備的低脫乙酰度殼聚糖(1H NMR鑒定其脫乙酰度為62%)為底物,使用該酶的誘導上清液對其進行充分水解,對水解產(chǎn)物(記為CHIB-62)進行MALDI-TOF MS分析(圖2)以確定其主要寡糖組成。結(jié)果顯示,水解物中存在聚合度2~9、不同脫乙酰度的殼寡糖組分;所有的寡糖組分中均含有N-乙酰氨基葡萄糖,這也與幾丁質(zhì)酶特異性識別該單糖相符。該結(jié)果也說明,利用全基因合成方法合成并克隆表達的CHIB確實具有幾丁質(zhì)酶活性。

        圖2 CHIB-62 MALDI-TOF MS分析Fig. 2 MALDI-TOF MS analysis of CHIB-62

        2.3 低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62分子質(zhì)量分布

        MALDI-TOF MS方法在反射模式下只能對分子質(zhì)量較?。ㄈ缦鄬Ψ肿淤|(zhì)量小于2 000)的組分進行測定。為確定CHIB-62中寡糖的真實分子質(zhì)量分布,使用SE-HPLC對其進行分析。結(jié)果顯示,CHIB-62在1 000~5 000的相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)均有殼寡糖分布(圖3)。以上結(jié)果說明,利用CHIB水解低脫乙酰度殼聚糖,除相對分子質(zhì)量2 000以下的殼寡糖外,還可以獲得更高分子質(zhì)量的產(chǎn)物。殼寡糖生物活性的發(fā)揮與其相對分子質(zhì)量大小直接相關(guān)。因此,CHIB-62可能比傳統(tǒng)方法制備的高脫乙酰度殼寡糖(相對分子質(zhì)量一般小于2 000)具有更高或者全新的生物活性。

        圖3 CHIB-62的SE-HPLC圖譜Fig. 3 SE-HPLC analysis of CHIB-62

        2.4 低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62末端結(jié)構(gòu)鑒定

        1H NMR對CHIB-62的末端結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,CHIB-62中的殼寡糖還原端主要為兩個連續(xù)的N-乙酰氨基葡萄糖(-AA,圖4A);13C NMR分析結(jié)果顯示,CHIB-62的非還原端主要為氨基葡萄糖(D-),也包含少量的N-乙酰氨基葡萄糖(A-),具體如圖4B所示。13C NMR結(jié)果還顯示,殼寡糖的中間區(qū)域單糖組成中,兩個連續(xù)的N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)(-AA-)明顯少于其他結(jié)構(gòu),而兩個連續(xù)的氨基葡萄糖(-DD-)則明顯多于其他結(jié)構(gòu),說明在幾丁質(zhì)酶水解的過程中,前者(-AA-)容易被識別并水解,而后者(-DD-)則因不被水解而富集。該結(jié)果也與幾丁質(zhì)酶的水解特性相符。Nakamura等[29]已經(jīng)對CHIB中的催化區(qū)結(jié)構(gòu)進行了解析,結(jié)果顯示,該酶屬于糖苷酶18家族,而該家族幾丁質(zhì)酶水解的特征便是需要結(jié)合-1位的N-乙酰氨基葡萄糖,從而使其產(chǎn)物的還原端均由該單糖單元組成,這也與本研究1H NMR分析結(jié)果一致。1H NMR結(jié)果還進一步顯示CHIB的水解產(chǎn)物還原末端主要由-AA結(jié)構(gòu)構(gòu)成,這與來源于黏質(zhì)沙雷菌的幾丁質(zhì)外切酶的水解特性相似[30]。而前期結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果提示CHIB為內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶,水解實驗中,CHIB能夠?qū)Φ孜镞M行快速水解也初步驗證了該推測[25]。因此,CHIB作為來源于古菌的幾丁質(zhì)酶,具有自身的水解特征,即可以通過內(nèi)切方式快速水解低脫乙酰底物,獲得的產(chǎn)物末端主要由-AA結(jié)構(gòu)構(gòu)成。這些部分確定結(jié)構(gòu)的殼寡糖對于其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究意義重大。

        圖4 CHIB-62的1H NMR(A)及13C NMR(B)鑒定Fig. 4 1H NMR (A) and 13C NMR (B) identification of CHIB-62

        3 結(jié) 論

        本研究利用全基因合成方法合成并克隆表達了來源于強烈熾熱球菌的幾丁質(zhì)酶,并利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖制備了低脫乙酰度殼寡糖CHIB-62。組分分離及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示,CHIB-62的分子質(zhì)量分布范圍為1 000~5 000,所有寡糖組分中均帶有N-乙酰氨基葡萄糖;不僅如此,寡糖的還原末端主要由兩個連續(xù)的N-乙酰氨基葡萄糖構(gòu)成。與傳統(tǒng)殼寡糖相比,CHIB-62含有更多較高聚合度的殼寡糖組分,帶有更多的N-乙酰氨基葡萄糖且還原末端組分確定,可能具有新的或者更高的生物活性。后續(xù)將對這些組分進行分離并對其生物活性進行更深入研究。

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