袁 林，曾 靜*，郭建軍，郭 浩，楊 罡，陳 俊

（江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096）

來源于極端嗜熱微生物的極端嗜熱酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫催化活性，對有機溶劑、去污劑、變性劑等具有很強的耐受性[1-3]。極端嗜熱酶作為生物催化劑參與高溫反應具有提高反應速率和產(chǎn)率、防止常溫微生物的污染、減少能耗等優(yōu)點，因此極端嗜熱酶廣泛應用于工業(yè)領域和生物技術領域[4-5]。極端嗜熱酸性α-淀粉酶具有反應溫度高、熱穩(wěn)定性好、酸性條件下酶活力高等優(yōu)點，能夠克服淀粉液化工藝的主要缺點，如pH值的反復調節(jié)、高溫條件下淀粉酶活力的喪失以及隨之而產(chǎn)生的溫度調節(jié)等工藝，從而簡化淀粉液化工藝流程、避免pH值的反復調節(jié)、降低能耗[6-12]。因此極端嗜熱酸性α-淀粉酶在淀粉液化工藝中具有巨大的應用潛力。

極端嗜熱微生物是極端嗜熱酸性α-淀粉酶的直接來源。但是極端嗜熱微生物的培養(yǎng)條件嚴格，如其最適生長溫度在80 ℃以上，大多數(shù)極端嗜熱微生物是嚴格厭氧的，并且極端嗜熱微生物的產(chǎn)酶量低，因此直接從極端嗜熱微生物中分離獲得大量極端嗜熱酸性α-淀粉酶是較為困難的[3-4]。這限制了極端嗜熱酸性α-淀粉酶在淀粉液化工藝中的應用。因此采用基因工程和蛋白質工程方法將極端嗜熱酸性α-淀粉酶的基因進行克隆并將其在常溫宿主中進行表達，從而獲得適用于淀粉液化工藝的極端嗜熱酸性α-淀粉酶具有重要的應用價值?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有分泌能力強、培養(yǎng)條件和基因操作簡單、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點，被認為是理想的外源蛋白質的分泌表達宿主菌[13-14]。外源蛋白質在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中的分泌表達依賴于枯草芽孢桿菌信號肽的引導，并且信號肽與外源蛋白質之間存在適配性[15]。因此針對特定的蛋白質需要選擇合適的信號肽來實現(xiàn)有效的分泌表達。

來源于極端嗜熱古生菌（Pyrococcus furiosus）的極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA是目前已知的熱穩(wěn)定性最好的α-淀粉酶。PFA的最適反應溫度高達100 ℃，最適反應pH值為5.0，在未補加Ca2＋的條件下于98 ℃的半衰期長達13 h，并且其熱穩(wěn)定性和高溫活性均不依賴于Ca2＋[16-17]。鑒于PFA的優(yōu)良酶學性質，其在淀粉液化工藝中具有巨大的應用潛力，大量獲得PFA是其應用于淀粉液化工藝的前提條件。為探索極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌WB600中的高效分泌表達條件，本研究根據(jù)來源于枯草芽孢桿菌的9 種結構特征不同的Sec分泌途徑信號肽進行篩選，以獲得引導PFA高效分泌表達的信號肽。在此基礎上，為進一步優(yōu)化PFA的分泌表達，對篩選得到的信號肽進行突變，通過比較不同信號肽突變體的引導分泌效率，獲得引導分泌效率最優(yōu)的信號肽突變體，從而實現(xiàn)PFA在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600、枯草芽孢桿菌表達載體pSTOP1622均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌JM109和枯草芽孢桿菌WB600的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、低分子質量蛋白質Marker 美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國Omega Bio-Tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國GE Healthcare公司；Gibson Assembly Master Mix 美國NEB公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)或進口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 儀器與設備

Mastercycler gradient PCR儀 美國Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；MicroPulser電穿孔儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆技術和表達產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

分子克隆技術和表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻[18]進行。

1.3.2 重組質粒pSTOP1622-pfa的構建及鑒定

α-淀粉酶PFA基因pfa由上海博益生物科技有限公司合成。設計引物P1和P2對基因pfa進行PCR擴增（表1）。PCR擴增條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，74 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；74 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)BglII和KpnI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-pfa。采用BglII和KpnI雙酶切質粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構建重組質粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 信號肽篩選載體的構建與鑒定

根據(jù)PFA的基因序列設計PCR引物P3（表1），以合成基因pfa為模板，以P3、P2為引物，進行PCR擴增，獲得不含信號肽的結構基因pfads。擴增產(chǎn)物經(jīng)BglII和KpnI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-pfads。并采用BglII和KpnI雙酶切質粒鑒定是否有外源基因的插入。

采用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix構建包含枯草芽孢桿菌信號肽（表2）和重組載體pSTOP1622-pfads的信號肽篩選載體。所需引物（表1中P4和P5）按照該產(chǎn)品說明書的要求進行設計，PCR等相關操作按照該產(chǎn)品說明書進行。具體操作如下：以pSTOP1622-pfads為模板，采用引物P4、P5（表1），進行PCR擴增得到載體片段；PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 4 min，35 個循環(huán)；68 ℃ 10 min。在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢表2中信號肽的核苷酸序列，采用化學全合成方法分別合成包含同源臂和信號肽核苷酸序列的DNA片段（5’-CAAACTAGTTCGAAGATCT-信號肽核苷酸序列-AAGCTCCAAGTATTTTGC-3’）。PCR擴增得到的載體片段分別與不同的DNA片段混合，采用Gibson Assembly Master Mix進行無縫克隆，獲得包含不同信號肽的信號肽篩選載體。以信號肽篩選載體為模板，采用引物P6、P7（表1）進行PCR擴增，獲得包含信號肽核苷酸序列的約500 bp的DNA片段。將DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應信號肽基因序列進行比對確認。

表2 篩選信號肽的特征說明Table 2 Characteristics of different signal peptides

1.3.4 信號肽YfkN的突變

根據(jù)點突變試劑盒的說明，結合信號肽YfkN的核苷酸序列和擬突變的氨基酸位點設計引物，如表3所示。以信號肽篩選載體pSTOP1622-YfkN-pfads為模板，采用表3中引物進行PCR擴增，得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，68 ℃ 5 min，35 個循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶處理后，轉化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素抗性平板篩選轉化子，測序鑒定是否為突變基因。

表3 信號肽YfkN突變所用引物Table 3 Primer sequences used for the mutagenesis of signal peptide YfkN

續(xù)表3

1.3.5 枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞的制備和轉化

枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞的制備和轉化采用改進的Spizizen法[19]進行。

1.3.6 重組α-淀粉酶的誘導表達和純化

接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉速為200 r/min，培養(yǎng)時間為10 h。然后轉接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉速為200 r/min。當培養(yǎng)至菌體OD600nm達到1時，添加終質量濃度為0.5 g/100 mL的木糖，誘導細胞表達重組蛋白質，誘導時間為30 h。待發(fā)酵結束后，測定發(fā)酵上清液和重組枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的α-淀粉酶活力，分析表達情況。

采用Ni2＋親和層析柱對發(fā)酵上清液中目的蛋白質進行純化，用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組α-淀粉酶。利用SDS-PAGE檢測重組α-淀粉酶的純度，并采用Bradford法[20]測定重組α-淀粉酶含量。

1.3.7 α-淀粉酶活力測定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉的50 mmol/L MES，pH 5.0緩沖液混合，于95 ℃反應30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應，然后采用3,5-二硝基水楊酸法[21]測定反應體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.8 α-淀粉酶的酶學性質分析

按照上述反應體系混合酶液和底物，分別于40～130 ℃反應30 min，測定不同溫度下絕對酶活力，并以絕對酶活力對時間作圖，確定其最適反應溫度。

將酶液與不同pH值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液混合，于95 ℃進行酶活力測定。采用不同緩沖液配制不同pH值的1 g/100 mL可溶性淀粉溶液：50 mmol/L MES（pH 4.0～7.0）、50 mmol/L MOPS（pH 7.0～9.0）。

將酶液于100 ℃保溫，分時間梯度取出部分樣品，根據(jù)如上反應體系測定酶活力。將未處理酶液的酶活力定義為100%，并以相對酶活力對時間作圖，評價酶的熱穩(wěn)定性。

以上α-淀粉酶的酶學性質研究中均設置α-淀粉酶和補加5 mmol/L Ca2＋的α-淀粉酶作為實驗組。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

α-淀粉酶的酶學性質研究實驗中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 11.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的酶切鑒定

采用化學合成法合成了極端嗜熱α-淀粉酶PFA的基因pfa，將基因pfa連接至載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-pfa。以基因pfa為模板，采用PCR方法擴增基因pfa中除去編碼信號肽的基因序列的基因片段pfads，并連接至載體pSTOP1622，構建質粒pSTOP1622-pfads。采用限制性內(nèi)切酶BglII和KpnI酶切質粒pSTOP1622-pfads和pSTOP1622-pfa，得到大小分別約為6 000 bp和1 300 bp的兩個片段（圖1）。

圖1 重組質粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant vectors by restriction enzyme digestion

2.2 信號肽篩選載體的PCR鑒定

采用Gibson Assembly Master Mix進行無縫克隆，構建包含不同枯草芽孢桿菌信號肽和重組載體pSTOP1622-pfads的信號肽篩選載體。以不同的信號肽篩選載體和陰性對照pSTOP1622為模板，采用表1中引物P6、P7進行PCR擴增，擬獲得包含信號肽核苷酸序列和PFA部分編碼序列的約500 bp的DNA片段。如圖2所示，以陰性對照pSTOP1622為模板的反應無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，以信號肽篩選載體（pSTOP1622-pfa、pSTOP1622-BglC-pfads、pSTOP1622-YhfM-pfads、pSTOP1622-OppA-pfads、pSTOP1622-AprE-pfads、pSTOP1622-AmyE-pfads、pSTOP1622-Mpr-pfads、pSTOP1622-YfkN-pfads、pSTOP1622-Bpr-pfads、pSTOP1622-AbnA-pfads）為模板的反應均有約500 bp的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。將擴增得到的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并將測序結果與對應信號肽基因序列進行了比對確認（結果未顯示），證實各信號肽篩選載體均構建成功。

圖2 信號肽篩選載體的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of signal peptide screening vectors

2.3 重組α-淀粉酶的誘導表達

將陰性對照pSTOP1622以及不同的信號肽篩選載體分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。待表達完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力，同時采用SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中重組α-淀粉酶的表達情況。酶活力測定結果如圖3所示，α-淀粉酶PFA的信號肽PFA以及來源于枯草芽孢桿菌的信號肽BglC、YhfM、OppA、AprE、AmyE、Mpr、YfkN、Bpr、AbnA均能引導α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，其中信號肽YfkN優(yōu)于其他信號肽。相對于α-淀粉酶PFA的自身信號肽，使用信號肽YfkN后分泌表達量提高了約10 倍。此外，SDS-PAGE檢測結果（圖4）顯示，轉化了不同信號肽篩選載體的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液中有一條約45 kDa的蛋白質條帶，且使用信號肽YfkN后發(fā)酵上清液中重組α-淀粉酶的表達量顯著提高；以上重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體中能觀察到約48 kDa的蛋白質條帶，這可能是未經(jīng)信號肽引導分泌至胞外而滯留在胞內(nèi)的蛋白質前體物質。轉化了陰性對照pSTOP1622的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中均未能檢測到對應大小的蛋白質條帶。SDS-PAGE檢測結果與酶活力檢測結果是相對應的。

圖3 不同信號肽對酶活力的影響Fig. 3 Signal peptide dependence of α-amylase activity

圖4 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

2.4 YfkN信號肽優(yōu)化對α-淀粉酶PFA分泌表達的影響

研究表明，枯草芽孢桿菌信號肽的組成結構會影響其對蛋白質的引導分泌效率，其中增加信號肽N端帶正電荷氨基酸數(shù)量可能提高蛋白質的分泌效率[15]。本研究通過對信號肽YfkN的N端中不帶電荷氨基酸殘基Ile3和Gln4進行飽和突變，并比較信號肽YfkN與其突變體對α-淀粉酶PFA的引導分泌效率確定YfkN信號肽優(yōu)化對α-淀粉酶PFA分泌表達的影響。

2.4.1 YfkN信號肽中Ile3的飽和突變對PFA分泌表達的影響

對信號肽YfkN的Ile3進行飽和突變，獲得包含不同信號肽突變體的表達載體。將陰性對照pSTOP1622以及不同的表達載體分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。待表達完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力。酶活力測定結果如圖5所示，信號肽YfkN以及其Ile3的飽和突變體均能引導α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，并且信號肽突變體I3G優(yōu)于其他信號肽。使用信號肽突變體I3G后重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至578.5 U/mL。此外，酶活力測定結果也顯示信號肽突變體I3P、I3F、I3W、I3D、I3E、I3T、I3N、I3S、I3Q、I3Y、I3C、I3M的引導分泌效率明顯低于信號肽YfkN，這說明以上氨基酸殘基的替換不利于信號肽引導α-淀粉酶PFA分泌至胞外。

圖5 不同信號肽對酶活力的影響Fig. 5 Signal peptide dependence of α-amylase activity

2.4.2 YfkN信號肽中Gln4的飽和突變對PFA分泌表達的影響

對信號肽YfkN的Gln4進行飽和突變，獲得包含不同信號肽突變體的表達載體。將陰性對照pSTOP1622以及不同的表達載體分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。待表達完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶的活力。如圖6所示，信號肽YfkN以及其Gln4的飽和突變體均能引導α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中，并且信號肽突變體Q4R優(yōu)于其他信號肽。使用信號肽突變體Q4R后重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至617.5 U/mL。此外，酶活力測定結果也顯示對于Gln4位點，采用氨基酸殘基Pro、Phe、Trp、Asp、Glu、Thr、Asn、Ser、Tyr進行替換不利于信號肽引導α-淀粉酶PFA分泌至胞外。

圖6 不同信號肽對酶活力的影響Fig. 6 Signal peptide dependence of α-amylase activity

2.4.3 YfkN信號肽突變體對PFA分泌表達的影響

圖7 不同信號肽對酶活力的影響Fig. 7 Signal peptide dependence of α-amylase activity

圖8 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE圖Fig. 8 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

將陰性對照pSTOP1622、質粒pSTOP1622-YfkN-pfads、pSTOP1622-I3G-pfads、pSTOP1622-Q4R-pfads、pSTOP1622-I3G/Q4R-pfads分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。待表達完成后，分別收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體，測定發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中α-淀粉酶活力，同時采用SDSPAGE分析發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中重組α-淀粉酶的表達情況。酶活力測定結果（圖7）表明，與信號肽YfkN相比，信號肽突變體I3G、Q4R和I3G/Q4R對α-淀粉酶PFA的引導分泌效率逐步提高。其中使用信號肽突變體I3G/Q4R后，重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力由539.5 U/mL提高至715 U/mL。此外，SDS-PAGE檢測結果（圖8）與酶活力檢測結果相一致，使用信號肽突變體I3G/Q4R后，α-淀粉酶PFA的胞外表達量更高。以上結果表明，采用氨基酸殘基Gly替換第3位Ile，并采用氨基酸殘基Arg替換第4位Gln，有利于信號肽引導α-淀粉酶PFA分泌到發(fā)酵上清液中。

2.5 重組α-淀粉酶的酶學性質

2.5.1 pH值對重組α-淀粉酶活力的影響

圖9 pH值對酶活力的影響Fig. 9 pH dependence of α-amylase activity

如圖9所示，對于不含Ca2＋和含有5 mmol/L Ca2＋的重組α-淀粉酶PFA，最適反應pH值均約為5.0，于pH 4.0～6.0之間可保持60%以上的相對酶活力。即額外添加的Ca2＋不影響重組α-淀粉酶PFA的最適反應pH值。

2.5.2 溫度對重組α-淀粉酶活力的影響

圖10 溫度對酶活力的影響Fig. 10 Temperature dependence of α-amylase activity

如圖10所示，PFA的最適反應溫度為100 ℃，在此溫度下的絕對酶活力為3 820.64 U/mg；在額外補加5 mmol/L Ca2＋的情況下，PFA的最適反應溫度為100 ℃，在此溫度下的絕對酶活力為3 860.18 U/mg。此外，在40～130 ℃之間，額外補加的Ca2＋幾乎不影響PFA的絕對酶活力。

2.5.3 重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性

如圖11所示，在100 ℃條件下，重組α-淀粉酶PFA和含有5 mmol/L Ca2＋的重組α-淀粉酶PFA均具有較好的熱穩(wěn)定性，并且兩者于100 ℃的熱穩(wěn)定性基本一致。PFA和含有5 mmol/L Ca2＋的PFA于100 ℃的半衰期均約為13 h。

圖11 100 ℃重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig. 11 Thermal stability of α-amylases at 100 ℃

3 討 論

枯草芽孢桿菌是傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有極強的蛋白質表達和分泌能力[13-14]。將枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)點如培養(yǎng)條件和基因操作簡單、發(fā)酵工藝成熟等與其自身信號肽相結合，構建外源蛋白質的分泌表達系統(tǒng)，可以實現(xiàn)外源蛋白質的分泌表達，從而提高外源蛋白質的可溶性，避免因形成包涵體以及隨之而來的復性和產(chǎn)物純化等困難[13-14]?，F(xiàn)有的研究表明來源于枯草芽孢桿菌的信號肽與外源蛋白質之間存在適配性問題[15]。對于同一種外源蛋白質，不同信號肽的引導分泌效率相差較大。因此針對特定的外源蛋白質需要選擇合適的信號肽來實現(xiàn)其有效的分泌表達。目前尚無法預測哪種信號肽能夠高效引導目的蛋白質分泌到胞外，只能通過實驗手段從大量信號肽中篩選得到高效引導目的蛋白質分泌到胞外的信號肽[15]。Guan Chengran等[22]為提高氨基肽酶在枯草芽孢桿菌中的分泌效率，從含有19 種Sec分泌途徑的信號肽庫中篩選得到信號肽YncM。相對于氨基肽酶自身信號肽，信號肽YncM對氨基肽酶的引導分泌效率提高了1.2 倍。Zhang Weiwei等[23]通過篩選114 種來源于枯草芽孢桿菌的Sec途徑信號肽，獲得高效引導木聚糖酶分泌至胞外的信號肽PhoB。本研究為探索極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌WB600中的高效分泌表達條件，對來源于枯草芽孢桿菌的9 種結構特征不同的Sec分泌途徑信號肽進行篩選，并獲得引導PFA高效分泌表達的信號肽YfkN。與α-淀粉酶PFA的自身信號肽相比，使用信號肽YfkN后PFA的分泌表達量提高了約10 倍。

信號肽的結構由N端、H段、C端構成，其中N端由1～5 個帶正電荷的氨基酸組成、H段由7～15 個疏水性氨基酸組成、C端由3～7 個能被信號肽酶識別并切割的親水性氨基酸組成[24-25]。研究表明，信號肽的結構如N端帶正電荷氨基酸數(shù)量、H段疏水性強弱、C端的氨基酸序列均影響信號肽的分泌效率，但并不能完全決定信號肽的分泌效率[24-25]。此外，外源蛋白質的分泌表達效率與多種因素相關，例如連接有不同信號肽的mRNA的穩(wěn)定性差異、蛋白質前體與細胞膜的結合、蛋白質跨膜過程中所涉及的分子伴侶以及異位復合物的有效性等[24-25]。Caspers等[26]通過研究枯草芽孢桿菌信號肽對來源于Fusarium solanipisi的角質酶在枯草芽孢桿菌中分泌表達的影響發(fā)現(xiàn)，信號肽AmyE的N端帶正電荷氨基酸數(shù)量與其分泌表達效率并無正相關性，角質酶在胞內(nèi)的合成效率與其分泌至胞外的分泌效率之間的動態(tài)平衡是其高效分泌表達的關鍵。本研究通過對信號肽YfkN的N端中非正電荷氨基酸Ile3和Gln4進行飽和突變，獲得了引導分泌效率更優(yōu)的突變體I3G/Q4R。本研究結果也表明信號肽YfkN的N端帶正電荷數(shù)量與其引導PFA的分泌效率并無正相關性。

本研究對信號肽YfkN進行突變優(yōu)化，獲得了引導分泌效率更優(yōu)的信號肽突變體I3G/Q4R。使用了信號肽I3G/Q4R后，重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力高達715 U/mL。相對于α-淀粉酶PFA的自身信號肽，其分泌效率提高了約13 倍。根據(jù)前人研究結果，α-淀粉酶PFA已在不同的中溫原核表達系統(tǒng)中成功表達。其中，PFA在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行胞內(nèi)表達，胞內(nèi)α-淀粉酶活力約為195 U/mL[27-28]；PFA在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中使用其自身的表達元件進行胞外表達，胞外α-淀粉酶活力約為0.7 U/mL[17]；PFA在酵母表達系統(tǒng)中進行胞外表達，胞外α-淀粉酶活力約為220 U/mL[29]；PFA在經(jīng)遺傳修飾的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens中進行胞外表達，胞外α-淀粉酶活力約為2 000 U/mL[30]。本研究在傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌中，通過信號肽的篩選和信號肽優(yōu)化，實現(xiàn)極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA的高效分泌表達。本研究所獲得的重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力與前人研究結果尚存在一定的差距，接下來工作可以通過優(yōu)化本研究所獲得的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進一步提高胞外α-淀粉酶活力。此外，本研究于枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中所獲得的重組α-淀粉酶PFA的酶學性質與原始菌Pyrococcus furiosus中獲得的α-淀粉酶PFA的酶學性質基本一致：最適反應pH值為5.0，最適反應溫度為100 ℃，于100 ℃的半衰期長達13 h，并且不依賴于Ca2＋。α-淀粉酶PFA的高溫活性、熱穩(wěn)定性以及酸性條件下酶活等酶學性質能夠滿足淀粉液化工藝對α-淀粉酶的要求，在淀粉液化工藝中具有巨大的應用潛力，本研究所獲得研究成果為其在淀粉液化工藝中的應用提供了理論支持。