吳 敏，張宇馨，胡雪芹，張洪斌*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

右旋糖酐酶是一種能專一性斷裂右旋糖酐α-1,6糖苷鍵的水解酶，主要催化產(chǎn)物包括低聚右旋糖酐以及低聚異麥芽糖等。低聚右旋糖酐T70、T40、T20是重要的血漿代用品，具有補(bǔ)充血容量、改善微循環(huán)等作用[1]。低聚異麥芽糖是一種功能性低聚糖，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的作用[2-3]。除此之外，右旋糖酐酶及其衍生物還可用于糖蜜制作和飲料加工[4]、防治齲齒、保持口腔衛(wèi)生[5-6]等，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于右旋糖酐酶的研究主要集中在產(chǎn)生菌株的挖掘以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，但野生菌株遺傳背景不清晰、代謝復(fù)雜等缺陷[7]，極大程度限制了右旋糖酐酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。為解決這一問題，國內(nèi)外學(xué)者開始在工程菌中對(duì)右旋糖酐酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，其中畢赤酵母以其綠色安全、表達(dá)量高的優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注。1996年Roca等[8]首次在畢赤酵母菌株中表達(dá)了朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum IMI068219），甲醇誘導(dǎo)106 h后右旋糖酐酶產(chǎn)量達(dá)到3.2 g/L，酶活力為65.3 U/mg。梁達(dá)奉[9]分別構(gòu)建了誘導(dǎo)型、組成型2 種不同的重組酵母菌分泌表達(dá)朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4），搖瓶酶活力分別為75、60.4 U/mL。黃曾慰等[10]通過密碼子優(yōu)化進(jìn)一步提高朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4）在畢赤酵母中異源表達(dá)產(chǎn)量。青霉菌是右旋糖酐酶的主要來源菌屬，包括繩狀青霉[11]、點(diǎn)青霉[12-13]、嗜松青霉[14]、朱黃青霉、棘孢青霉[15-16]等。但目前關(guān)于青霉菌屬右旋糖酐酶的克隆表達(dá)主要集中于朱黃青霉，其他青霉屬右旋糖酐酶的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，棘孢青霉F1001[16]是本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的高產(chǎn)右旋糖酐酶菌株，具有較高的產(chǎn)酶能力，所分泌表達(dá)的右旋糖酐酶是內(nèi)切型右旋糖酐酶并具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的克隆表達(dá)分析有利于加強(qiáng)對(duì)青霉屬右旋糖酐酶的認(rèn)識(shí)，也有利于提高右旋糖酐酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)合成了棘孢青霉F1001右旋糖酐酶基因（GenBank登錄號(hào)KF999646.1）并對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化，分別將優(yōu)化前后的右旋糖酐酶基因序列克隆至畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，特異性篩選獲得陽性菌株。對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察并對(duì)搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘孢青霉H5、大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母X33、質(zhì)粒pPICZαA 美國Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶 北京全式金生物有限公司；Trizol提取試劑盒、第1鏈cDNA合成試劑盒、博來霉素 生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LLB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0。棘孢青霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基：右旋糖酐T70 15 g/L、蛋白胨5 g/L、K2PO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7 H2O 0.5 g/L，pH 5.5。BMGY培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、無氨基酵母氮源YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 g/L。BMMY培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、體積分?jǐn)?shù)1%甲醇。

藍(lán)色右旋糖酐T-2000平板：藍(lán)色右旋糖酐20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L，在倒置的皿蓋上加入1%（相對(duì)于固體培養(yǎng)基體積）甲醇。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

棘孢青霉培養(yǎng)：PDA平板連續(xù)活化棘孢青霉菌株，單菌落接種至棘孢青霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（50 mL/250 mL錐形瓶），30 ℃，250 r/min培養(yǎng)5 d。

大腸桿菌培養(yǎng)：將大腸桿菌接入50 mL LLB培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

畢赤酵母培養(yǎng)：將重組菌單菌落接入30 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜至OD600nm值為5，然后以體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL BMGY培養(yǎng)基中去葡萄糖抑制，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為4～6時(shí)，離心，BMMY重懸菌體，25 ℃、250 r/min培養(yǎng)，每24 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)1%誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.3.2 酶活力和總蛋白的測定

右旋糖酐酶活力測定采用還原糖測定方法——DNS法[17]：發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液稀釋一定倍數(shù)。將4 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐T70溶液置于35 ℃保溫10 min后加入1 mL稀釋的酶液，保溫1 h后，取樣500 μL，與375 μL DNS混合，沸水浴5 min，冷卻至室溫定容至終體積5.375 mL。滅活的酶液作為對(duì)照組，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

總蛋白測定：利用Bradford法[18]測定蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1 mL發(fā)酵液與4 mL考馬斯亮藍(lán)G250在常溫下反應(yīng)10 min后，在595 nm波長下測定吸光度，計(jì)算蛋白含量。

1.3.3 dex基因合成

活化培養(yǎng)棘孢青霉菌，離心收集菌體，無菌水洗滌，液氮研磨，試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈DNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的右旋糖酐酶基因序列進(jìn)行分析，以朱黃青霉HI-4（GenBank號(hào)L41562.1）編碼序列為模板，設(shè)計(jì)特異性上游引物F、下游引物R（表1），以第1鏈DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）特異性擴(kuò)增，得到雙鏈DNA片段，即dex基因序列，通過T克隆與pMD18-T載體連接，熱擊轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中，藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆子，測序獲得棘孢青霉右旋糖酐酶基因序列，并將序列提交至GenBank。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 右旋糖酐酶密碼子優(yōu)化

利用軟件Gene Designer對(duì)棘孢青霉右旋糖酐酶基因dex進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過同義密碼子替換的方式調(diào)整目的基因GC相對(duì)含量以及密碼子偏好指數(shù)，序列文件送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.3.5 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)右旋糖酐酶序列文件設(shè)計(jì)合成引物（表1），分別在上下游引物中添加EcoRI以及NotI位點(diǎn)（下劃線表示），并在上游引物中引入Kozark序列（加粗部分）。PCR分別擴(kuò)增dex、opt-dex序列后通過雙酶切的方式與載體pPICZαA連接，42 ℃熱擊將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中，在含有博來霉素抗性的LLB平板上篩選重組質(zhì)粒，PCR以及雙酶切鑒定陽性克隆并測序。

1.3.6 重組畢赤酵母構(gòu)建及表達(dá)

SacI線性化重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，通過高質(zhì)量濃度博來霉素（100、200、300、400、500 μg/mL）連續(xù)篩選，然后將篩選獲得的單克隆點(diǎn)種在藍(lán)色右旋糖酐T-2000平板進(jìn)行特異性篩選，陽性菌落能夠分泌產(chǎn)生右旋糖酐酶水解藍(lán)色右旋糖酐T-2000，在單菌落周圍形成透明圈。選取能產(chǎn)生水解圈的單克隆進(jìn)行搖瓶表達(dá)，并根據(jù)1.3.2節(jié)測定誘導(dǎo)發(fā)酵96 h的重組酶活力，篩選產(chǎn)酶能力高的重組酵母菌株。

1.3.7 重組右旋糖酐酶分離純化

將500 mL發(fā)酵粗酶液與500 mL冰預(yù)冷丙酮混合，4 ℃靜置10 min，8 000 r/min離心15 min棄上清液，用冰預(yù)冷丙酮洗滌3 次后，取10 mL 0.02 mol/L pH 5.0醋酸鹽緩沖液溶解沉淀，粗酶液濃縮50 倍。將10 mL濃縮液與磁珠混合，在磁場作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白與鎳離子的結(jié)合、雜蛋白洗脫以及目標(biāo)蛋白的分離，獲得較高純度的重組右旋糖酐酶，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢驗(yàn)純化效果。

1.3.8 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)測定

在15～70 ℃分別測定重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶的最適反應(yīng)溫度，并在梯度溫度下保溫1 h考察重組酶熱穩(wěn)定性，以酶活力最高為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力；配制pH 2～9的緩沖液，測定不同pH值環(huán)境中重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶最適反應(yīng)pH值，并在梯度pH值條件下孵育1 h后考察重組酶的pH值耐受性，以酶活力最高為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

選擇含有不同鍵型的多糖，測定不同底物催化條件下的重組酶活力，考察重組右旋糖酐酶的底物特異性。然后選擇重組右旋糖酐酶的最適反應(yīng)底物，配制成不同濃度的底物溶液，測定重組右旋糖酐酶反應(yīng)初速率，計(jì)算得到重組酶的米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速率vmax。

1.3.9 搖瓶優(yōu)化單因素試驗(yàn)

為進(jìn)一步提高畢赤酵母分泌表達(dá)外源蛋白能力，對(duì)畢赤酵母搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，基本培養(yǎng)條件同1.3.1節(jié)?？疾烀?4 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%時(shí)重組酵母產(chǎn)酶能力；考察搖瓶裝液量為25、50、100、150、200 mL/500 mL時(shí)重組酵母產(chǎn)酶能力；考察培養(yǎng)基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力；考察誘導(dǎo)溫度為20、25、30 ℃時(shí)重組酵母菌產(chǎn)酶能力；接著優(yōu)化非離子表面活性劑吐溫-80、吐溫-20及其不同添加量對(duì)重組酵母產(chǎn)酶影響；優(yōu)化碳源種類山梨醇、甘油及其添加量對(duì)重組菌產(chǎn)酶能力的影響。實(shí)驗(yàn)均做3 個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)差在圖中以誤差線標(biāo)示。

2 結(jié)果與分析

2.1 dex基因合成結(jié)果

提取棘孢青霉總RNA，如圖1A所示，獲得28S、18S的rRNA條帶，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明總RNA質(zhì)量良好。再以總RNA中的mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增得到右旋糖酐酶基因dex，如圖1B所示，基因長度為1 866 bp。

圖1 棘孢青霉右旋糖酐酶基因電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the Penicillium aculeatum gene encoding dextranase

2.2 基因密碼子優(yōu)化

表2 棘孢青霉右旋糖酐酶基因優(yōu)化前后密碼子使用頻率Table 2 Codon usage frequency of dex and opt-dex in Pichia pastoris

通過同義突變，將在畢赤酵母中利用的低頻密碼子替換成高頻密碼子，右旋糖酐酶基因序列優(yōu)化前后密碼子分布如表2所示，例如編碼Ala的GCG密碼子在畢赤酵母中使用頻率極低，僅6.1%，因此優(yōu)化后的右旋糖酐酶序列中不再使用GCG編碼Ala，采用酵母偏好性較高的GCT進(jìn)行編碼。再綜合考慮基因序列的GC相對(duì)含量、酶切位點(diǎn)、不穩(wěn)定序列等因素，優(yōu)化后的基因序列的密碼子偏好指數(shù)從原始序列的0.65調(diào)整至0.92（密碼子偏好指數(shù)在0.8～1.0之間更有利于外源蛋白的表達(dá)），序列GC相對(duì)含量從49.4%降至38.3%，去除了原始序列中的TAAAT不穩(wěn)定序列。

2.3 重組畢赤酵母構(gòu)建及表達(dá)結(jié)果

分別將dex與opt-dex基因與表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZαA連接，SacI線性化后電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33基因組中，藍(lán)色右旋糖酐平板篩選結(jié)果如圖2所示，圖2A、2B分別表示密碼優(yōu)化后opt-dex以及密碼子優(yōu)化前dex序列在畢赤酵母中的表達(dá)情況。并且圖2A顯示甲醇誘導(dǎo)24 h后的情況，圖2B表示甲醇誘導(dǎo)72 h后才出現(xiàn)微弱的水解圈，可以初步判斷密碼子opt-dex序列在畢赤酵母中具有更高的右旋糖酐酶表達(dá)能力。

進(jìn)一步選擇圖2A中水解圈較明顯的A1、A3、A5、A6、A7、A10以及圖2B中唯一的陽性菌落B13進(jìn)行搖瓶表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，B13的表達(dá)能力明顯低于A組菌株。其中A組中A5具有較高產(chǎn)酶活力，在搖瓶的表達(dá)酶活力達(dá)到89.56 U/mL，選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 陽性克隆子篩選Fig. 2 Selection of positive transformants

圖3 轉(zhuǎn)化子的搖瓶發(fā)酵篩選Fig. 3 Selection of transformants producing dextranase by shake flask fermentation

2.4 重組右旋糖酐酶分離純化結(jié)果

發(fā)酵粗酶液經(jīng)濃縮后如圖4A所示，樣品中含有大量的雜蛋白條帶以及其他雜質(zhì)成分，以至于對(duì)其他泳道造成了嚴(yán)重的擠壓。磁珠純化后的重組右旋糖酐酶如圖4B所示，目標(biāo)條帶單一，說明純化后的酶液具有較高純度。SDS-PAGE同時(shí)也表明重組右旋糖酐酶大小為65 kDa，與理論蛋白大小符合。

圖4 重組右旋糖酐酶純化結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant dextranase

2.5 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 重組右旋糖酐酶最適催化條件及穩(wěn)定性

如圖5A所示，重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃，隨著溫度升高酶活力逐漸降低，但在70 ℃的高溫條件下進(jìn)行催化反應(yīng)仍然能夠表現(xiàn)出40%的剩余酶活力。與天然棘孢青霉右旋糖酐酶相比較[16]，具有相同的最適催化溫度，以及相似的對(duì)高溫和低溫的酶活力響應(yīng)趨勢。但是在溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，天然酶在45 ℃中保存1 h仍然保留95.67%的酶活力，而重組酶在45 ℃保溫1 h剩余酶活力僅為75%，并且在50 ℃保溫1 h后重組右旋糖酐酶剩余酶活力降低至46%，而天然酶剩余活力在80%以上[16]。說明經(jīng)過酵母表達(dá)的重組右旋糖酐酶在溫度穩(wěn)定性上與天然酶相比有一定程度的降低。

對(duì)重組右旋糖酐酶的最適催化pH值考察，結(jié)果如圖5B所示，發(fā)現(xiàn)其最適催化pH值為5.0，當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，酶活力迅速降低，當(dāng)pH值升高到9.0時(shí)，重組右旋糖酐酶幾乎全部失活。重組右旋糖酐酶在pH 4.0～7.0緩沖液中孵育1 h后能夠保留80%以上的酶活力。重組酶的最適催化pH值以及在不同pH值條件下的穩(wěn)定性與天然棘孢青霉右旋糖酐酶一致[16]。

圖5 重組右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)Fig. 5 Enzymatic properties of the recombinant dextranase

2.5.2 重組右旋糖酐酶底物特異性

由表3可知，將重組右旋糖酐酶作用于不同的糖類底物，發(fā)現(xiàn)了與天然右旋糖酐酶相同的底物特異性，即專一性作用于α-1,6糖苷鍵，不作用于β-1,4、β-1,2以及α-1,2等其他糖苷鍵型。以右旋糖酐T70為底物，配制0.1%～1.0%的底物溶液，計(jì)算得到重組右旋糖酐酶的Km為87.56 μmol/L，vmax為428.02 μmol/（min·mg）。

2.6 搖瓶水平重組酵母發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境對(duì)酵母分泌表達(dá)能力具有很大的影響[19]，因此可以嘗試通過改善酵母的發(fā)酵條件提高酵母分泌表達(dá)外源蛋白的能力。首先對(duì)重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵pH值、誘導(dǎo)劑添加量、表面活性劑含量、碳源添加量、裝液量等參數(shù)進(jìn)行單因素優(yōu)化。結(jié)果表明單因素優(yōu)化后的培養(yǎng)條件使重組酶活力提高了2.6 倍，從初始的89.56 U/mL提高到了240.74 U/mL，總蛋白質(zhì)量濃度為0.068 mg/mL。

在重組畢赤酵母中甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子表達(dá)重組右旋糖酐酶，如圖6A所示，當(dāng)甲醇添加量為1.0%（每24 h）時(shí)重組酶活力達(dá)到122 U/mL。高于1.0%（每24 h）時(shí)，隨著甲醇添加量的增加，酶活力逐漸降低。通過搖瓶中的裝液量控制通氣量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6B所示，500 mL錐形瓶中裝液量為25 mL、50 mL時(shí)產(chǎn)酶量相當(dāng)，以50 mL時(shí)為最佳。發(fā)酵pH值優(yōu)化結(jié)果如圖6C所示，當(dāng)pH 5.0時(shí)酶活力最高，酸性堿性環(huán)境下產(chǎn)酶量急劇降低。低溫發(fā)酵能夠降低中性蛋白酶對(duì)目標(biāo)外源蛋白的降解，促進(jìn)新生肽的折疊，提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，以及減輕發(fā)酵過程的氧氣壓力[20-21]。在20、25、30 ℃三個(gè)溫度梯度下考察右旋糖酐酶活力，如圖6D所示，25 ℃時(shí)重組右旋糖酐酶活力為30 ℃時(shí)的1.6 倍。20 ℃發(fā)酵120 h酶活力與25 ℃發(fā)酵96 h酶活力相當(dāng)，以25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。非離子表面活性劑具有增加細(xì)胞壁滲透的作用，從而提高重組酵母的分泌能力[22]?？疾焱聹?80、吐溫-20兩種常見的表面活性劑對(duì)酵母分泌的影響，如圖6E所示，當(dāng)吐溫-80添加量為4 g/L時(shí)，發(fā)酵上清液的右旋糖酐酶活力增加到230.74 U/mL。在甲醇發(fā)酵誘導(dǎo)階段，甲醇既作為碳源維持酵母生長，又作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白的合成[23]。在酵母發(fā)酵過程中以山梨醇或者甘油為協(xié)同底物提供酵母生長所需碳源，以減輕酵母代謝壓力[24-25]。如圖6F所示，以山梨醇作為碳源的效果明顯優(yōu)于甘油，當(dāng)山梨醇添加量為5 g/L時(shí)，重組右旋糖酐酶活力達(dá)到240.74 U/mL。

圖6 重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶水平的初步搖瓶優(yōu)化Fig. 6 Optimization of shake flask culture of the recombinant P. pastoris for dextranase production

3 討 論

目前已報(bào)道的右旋糖酐酶編碼基因主要來源于青霉菌屬、桿狀菌屬以及鏈球菌屬等，除朱黃青霉外其他青霉來源的右旋糖酐酶基因鮮有報(bào)道。因此通過對(duì)棘孢青霉來源的右旋糖酐酶的研究可以加深對(duì)青霉屬右旋糖酐酶的認(rèn)識(shí)。朱黃青霉右旋糖酐酶的最適催化溫度為55 ℃，高于天然棘孢青霉酶右旋糖酐酶的35 ℃，但其熱穩(wěn)定性差，在50 ℃條件下保溫15 min酶活力損失50%以上[9]，而棘孢青霉右旋糖酐酶在50 ℃保溫1 h后仍然能保留80%以上的酶活力，并且在最適溫度35 ℃條件下保溫2 d后仍然能保留88%的酶活力[16]。細(xì)麗毛殼菌來源的右旋糖酐酶目前已經(jīng)小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，該酶最適催化溫度為60 ℃、pH 5.5，專一性催化斷裂糖酐鏈中連續(xù)的α-1,6糖苷鍵，但該酶液同樣也存在溫度穩(wěn)定性差的現(xiàn)象，65 ℃時(shí)半衰期為10 min，60 ℃時(shí)半衰期為250 min[26]，而棘孢青霉右旋糖酐酶的溫度穩(wěn)定性表明在最適催化溫度條件下保藏24 h后，仍然能保留93.5%的酶活力，10 d后酶活力降至50%，說明與朱黃青霉右旋糖酐酶以及細(xì)麗毛殼菌右旋糖酐酶相比，棘孢青霉右旋糖酐酶雖然具有相對(duì)較低的最適催化溫度，但其具有更好的溫度穩(wěn)定性，更加適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)長時(shí)間的催化要求。

以棘孢青霉菌為模板，反轉(zhuǎn)錄合成右旋糖酐酶編碼基因，優(yōu)化序列后在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。畢赤酵母分泌表達(dá)的重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃、最適催化pH值為5.0，具有與天然酶相似的催化性質(zhì)。但在溫度穩(wěn)定性上略有降低，類似的情況也出現(xiàn)在斯達(dá)克油脂酵母（Lipomyces starkeyi 1390）來源的右旋糖酐酶基因的異源表達(dá)中，異源表達(dá)的重組右旋糖酐酶最適溫度為30 ℃，低于天然酶的55 ℃，最適pH 4.5，低于天然酶的5.0[27-28]，可能是因?yàn)楫愒幢磉_(dá)過程中不同的表達(dá)體系對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一定程度的修飾，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

在搖瓶水平上對(duì)重組酵母的產(chǎn)酶能力進(jìn)行單因素優(yōu)化，優(yōu)化后重組酶活力達(dá)到240.74 U/mL，高于Chen Lin等[27]在5 L發(fā)酵罐獲得83.9 U/mL的重組酶活力，Kang等[7]在10 L的發(fā)酵罐中獲得的134 U/mL的酶活力，低于梁達(dá)奉等[17]在5 L發(fā)酵罐中獲得的1 048 U/mL（誘導(dǎo)型）以及398 U/mL（組成型）重組酶活力，但高于其搖瓶單因素優(yōu)化后的75 U/mL（誘導(dǎo)型）以及60.4 U/mL（組成型）。說明重組棘孢青霉右旋糖酐酶在搖瓶水平的表達(dá)能力達(dá)到國內(nèi)現(xiàn)有水平。但是在搖瓶水平總蛋白質(zhì)量濃度低，僅為0.068 mg/mL，顯著低于Roca等[8]在10 L發(fā)酵罐中表達(dá)的右旋糖酐酶產(chǎn)量。但畢赤酵母是一種適合高密度發(fā)酵的菌株，在發(fā)酵罐中畢赤酵母分泌表達(dá)能力能夠顯著提高，例如里氏木霉Cel5基因在5 L發(fā)酵罐中酶活力相比搖瓶提高了11 倍[29]、雪白根霉在50 L發(fā)酵罐中的酶活力相對(duì)于搖瓶發(fā)酵提高了40 倍[30]。所以可期望通過高密度發(fā)酵條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高重組畢赤酵母分泌表達(dá)右旋糖酐酶的能力。

以棘孢青霉基因組為模板克隆得到右旋糖酐酶編碼基因，序列優(yōu)化后整合到畢赤酵母X33中，表達(dá)后的右旋糖酐酶具有與天然酶相似的酶學(xué)性質(zhì)，說明重組右旋糖酐酶可以代替天然棘孢青霉右旋糖酐酶直接應(yīng)用于工業(yè)催化制備右旋糖酐。條件優(yōu)化后重組畢赤酵母搖瓶產(chǎn)酶能力達(dá)到240.74 U/mL，達(dá)到國內(nèi)現(xiàn)有搖瓶表達(dá)水平。