趙烜影，苑秀娟，郭 鸰,*，董艷如，孫 琦

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.安達(dá)市畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 安達(dá) 151400）

發(fā)酵食品是指以微生物發(fā)酵為基礎(chǔ)而制作的一類食品的總稱，常見的發(fā)酵食品按原料來(lái)源可以分為發(fā)酵豆類制品、發(fā)酵谷類制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜類制品、發(fā)酵乳制品以及發(fā)酵茶制品[1]。在中國(guó)谷類發(fā)酵食品是最常見的主食，主要有饅頭、醪糟、面包、醋、酒、發(fā)酵米粉、面醬及發(fā)面餅類等[2]。饅頭、面包、包子、發(fā)面餅和黏豆包等需要將粉碎的面粉與其他成分（液體）揉捏形成面團(tuán)作為發(fā)酵的基礎(chǔ)，因此酵母和乳酸菌發(fā)酵的面粉與水的混合物構(gòu)建了一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)[3-6]。世界范圍內(nèi)的典型面團(tuán)生態(tài)系統(tǒng)有[7]：埃及Balady-Soltani酸面團(tuán)，發(fā)酵微生物主要是乳桿菌（約占63%～64%）；印度南部Idli酸面團(tuán)，其優(yōu)勢(shì)菌是腸系膜明串珠菌，其次為糞腸球菌，這種面團(tuán)與傳統(tǒng)以酵母菌起發(fā)的面團(tuán)不同，主要是由腸系膜明串珠菌起發(fā)產(chǎn)生；中歐式面團(tuán)Lindneri酸面團(tuán)中的代表微生物為從啤酒中分離得到的短乳桿菌；美國(guó)舊金山地區(qū)的San Francisco面團(tuán)中產(chǎn)酸主要微生物是異型發(fā)酵乳桿菌；伊朗Sangak酸面團(tuán)里產(chǎn)酸發(fā)酵的主要微生物是約占微生物數(shù)量77%以上的腸系膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。在穩(wěn)定的面團(tuán)中，通常含有特定的酵母菌和乳酸菌。多項(xiàng)相關(guān)研究報(bào)道指出，單一面團(tuán)在特定時(shí)間內(nèi)一般只含有一種或兩種酵母菌，其中矮小假絲酵母（Candida humilis）、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的出現(xiàn)較為頻繁[8]。Desiye等[9]應(yīng)用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)埃塞俄比亞主食之一煎餅Enjera中的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行了分離、鑒定和識(shí)別，在34 種樣品中得到107 株乳酸菌和68 株酵母菌。

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種不依賴于純培養(yǎng)的分離技術(shù)[10]，而且DGGE技術(shù)相較于瓊脂糖電泳和聚丙烯酰氨凝膠電泳分辨率高[11]，分析微生物群落可以獲取其高分辨率圖譜并對(duì)圖譜的信息進(jìn)行生物學(xué)上的合理解釋[12]。因其快速、靈敏、分析全面等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究中[13-14]。近年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)已經(jīng)直接應(yīng)用于食品領(lǐng)域[15-16]。烏日娜等[17]利用PCR-DGGE技術(shù)成功研究了酸湯子面團(tuán)中的微生物菌群多樣性。Ercolini等[18]應(yīng)用此技術(shù)純化天然乳清培養(yǎng)基的DNA片段，從中鑒定出德氏乳桿菌和乳球菌。Yoshikawa等[19]用活菌計(jì)數(shù)和DGGE分別監(jiān)測(cè)了小麥和酸面團(tuán)中菌群的動(dòng)態(tài)變化。

黏豆包又稱黃豆包或豆包，由大黃米或江米與玉米按一定比例混合經(jīng)自然發(fā)酵后，包裹紅豆餡蒸制而成的冷凍類面制食品。具體做法是把大黃米或江米泡12 h，適當(dāng)晾干后磨面，將黃米或江米與玉米適度混合，冷水和面，進(jìn)行發(fā)酵（一般1～3 d），待有酸味飄出，用手揉面，此步?jīng)Q定黏豆包制作的成功與否，及口感與色澤。將紅豆制餡，用揉好的面團(tuán)將豆餡包入，蒸制20 min即可。將這種易于儲(chǔ)藏、食材易得、營(yíng)養(yǎng)豐富的滿族特色美食推廣開來(lái)，豐富多樣化飲食餐譜，對(duì)黏豆包加工進(jìn)行升級(jí)與產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)傳統(tǒng)黏豆包的研究較少，僅有李琦等[20]對(duì)采用低溫長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵的自然發(fā)酵糯玉米黏豆包中優(yōu)勢(shì)乳桿菌進(jìn)行了純培養(yǎng)分離鑒定的研究，然而應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)其產(chǎn)品的研究鮮見詳細(xì)報(bào)道。其中黏豆包發(fā)酵面團(tuán)的微生物菌群結(jié)構(gòu)是影響產(chǎn)品功能特性的重要因素之一[21-24]，并且微生物菌群組成是發(fā)酵條件受限的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，同時(shí)也是黏豆包工業(yè)化生產(chǎn)受到阻礙的主因。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)黏豆包原料大黃米和江米，通過(guò)高溫過(guò)夜發(fā)酵，并利用16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)通用引物進(jìn)行PCR-DGGE指紋技術(shù)分析，對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包面團(tuán)中微生物菌群組成進(jìn)行快速、深入的探索，以期為實(shí)現(xiàn)黏豆包產(chǎn)品的工業(yè)化、規(guī)?；?、自動(dòng)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)抽取2012年11月份東北地區(qū)黑龍江省安達(dá)市不同家庭的傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包發(fā)酵終點(diǎn)面團(tuán)樣品5 種，其中3 種樣品為大黃米黏豆包發(fā)酵面團(tuán)，標(biāo)記為P1、P2、P3；另外2 種樣品為江米黏豆包發(fā)酵面團(tuán)，標(biāo)記為G1、G2；樣品P4為同一時(shí)間段實(shí)驗(yàn)室條件下模擬制備的大黃米黏豆包發(fā)酵面團(tuán)，無(wú)菌操作取樣并收集于已滅菌的收集盒中，保存于-20 ℃。

2×Taq PCR Master Mix（含染料）雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、F338-G、引物 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TCL-16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ABI-9700型PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP凝膠呈相系統(tǒng)、DGGE儀 美國(guó)Bio-Rad公司；紫外-可見透射反射儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)的收集

實(shí)驗(yàn)室條件下，模擬傳統(tǒng)黏豆包自然發(fā)酵面團(tuán)的制備流程如下：

原料取用市售大黃米與玉米面，大黃米用清水先淘洗以淘凈沙子，開水浸洗，浸泡大約10 h后，晾至大半干后用粉碎機(jī)磨成面。設(shè)定玉米面-大黃米面按質(zhì)量比1∶3混合均勻，再用熱水和面，摻水量約是面量的80%。先用少量開水燙面，再加溫水混合到面團(tuán)黏合而不黏手為合適。和好的面置42 ℃溫箱內(nèi)發(fā)酵12 h，取出翻新揉面揣平，再繼續(xù)醒發(fā)2 h。

1.3.2 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)中微生物總DNA提取

按1∶9（g/mL）的比例將面團(tuán)樣品與滅菌的0.9%食鹽水振蕩混勻，參照十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）-溶菌酶法[24]對(duì)樣品微生物總DNA提取。將得到DNA沉淀自然風(fēng)干，然后加入40 μL TE緩沖液（含10 μg/mL的RNaseA）溶解，37 ℃保溫2 h后，-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)采用表1中的通用引物對(duì)338f-GC和518r進(jìn)行擴(kuò)增[22-23]。PCR體系50 μL：4 μL（約50 ng）模板DNA，1 μL 338f-GC1，1 μL 518r，25 μL 2×Taq PCR Master Mix（含染料），去離子水補(bǔ)足總體系為50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，65～56 ℃（-1 ℃/ 2 個(gè)循環(huán)）退火1 min，72 ℃延伸1 min，20 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。對(duì)所得的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

酵母菌26S rDNA D1區(qū)采用表1中的通用引物對(duì)NL1-GC2和LS2進(jìn)行擴(kuò)增[25-26]。PCR體系50 μL：4 μL模板DNA，1 μL的NL1-GC2，1 μL的LS2，25 μL的2×Taq PCR Master Mix（含染料）用去離子水稀釋至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。對(duì)所得的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 PCR引物和GC夾序列Table 1 PCR primers and GC clamps used in this study

1.3.4 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)DGGE分析

電泳采用The DCodeTM Universal Mutation Detection System系統(tǒng)，基因片段大小在200 bp左右，選用8%的DGGE變性凝膠，16S rDNA V3區(qū)變性梯度為35%～60%，26S rDNA D1區(qū)變性凝膠梯度為35%～70%。電泳條件：上樣量為40 μL，1×TAE電泳緩沖液，60 ℃（DNA的最適變性溫度），電壓130 V，電泳時(shí)間8 h。電泳結(jié)束后，膠樣用GeneFinder核酸染料染色30 min。UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Quantity One軟件進(jìn)行相應(yīng)分析。所得到的DGGE圖譜中，在紫外割膠儀中用無(wú)菌手術(shù)刀將清晰、亮度較高且分離較明顯的優(yōu)勢(shì)帶切下，裝入無(wú)菌的EP管中。將切好的膠塊用100 μL去離子無(wú)菌水清洗2～3 次，然后再加入50 μL去離子無(wú)菌水將膠塊搗碎，4 ℃過(guò)夜后取其上清液作為模板，16S rDNA V3區(qū)去掉“GC夾”的338f和518r引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，26S rDNA D1區(qū)采用去掉“GC夾”的NL1和LS2引物對(duì)對(duì)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系及條件同1.3.3節(jié)。最后，將PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果對(duì)比GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用引物（表1），以提取獲得的6 種樣品的總DNA為模板，按照1.3.3節(jié)的體系及相應(yīng)的降落式PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，得到圖譜見圖1，Marker I標(biāo)記顯示其DNA片段對(duì)應(yīng)大小約為200 bp，而且獲得的條帶完整一致，無(wú)明顯雜帶，可認(rèn)定為目標(biāo)條帶。

圖1 不同黏豆包樣品16S rDNA V3區(qū)PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 PCR fingerprints of V3 region of bacterial 16S rDRNA genes from sticky bean stun samples

2.1.2 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)酵母菌26S rDNA D1區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

采用酵母菌26S rDNA D1區(qū)通用引物（表1），對(duì)提取獲得的6 種樣品的總DNA按照1.3.3節(jié)的體系及相應(yīng)的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到圖譜見圖2，D2000標(biāo)記顯示其DNA片段大小約為250 bp，獲得的條帶清晰均一，無(wú)明顯雜帶，因此可認(rèn)定為目標(biāo)條帶。

圖2 26S rDNA V3區(qū)PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 PCR fingerprints of D1 region of 26S rDNA genes of yeasts from different sticky bean bun samples

2.2 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)中菌群組成DGGE指紋圖譜分析

2.2.1 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)細(xì)菌DGGE指紋圖譜分析

表2 細(xì)菌和酵母菌DGGE條帶測(cè)序結(jié)果Table 2 Sequencing results of the bands selected from the bacteria and yeast DGGE profiles

DGGE圖譜條帶數(shù)目可以直觀地反映黏豆包發(fā)酵面團(tuán)樣品中細(xì)菌組成的多樣性。表2顯示，黏豆包面團(tuán)6 種樣品的細(xì)菌DGGE圖譜總共發(fā)現(xiàn)7 個(gè)特異性擴(kuò)增條帶，其條帶數(shù)量和細(xì)菌分布情況各不相同，說(shuō)明黏豆包面團(tuán)樣品中細(xì)菌分布有著較大的差異性。樣品G1、G2和P4中條帶數(shù)目與其他3 種樣品相比較多，說(shuō)明采用江米為原料制作黏豆包的樣品中細(xì)菌的種類比較豐富；P1的條帶數(shù)目最少，說(shuō)明原材料的選擇與制作人的技巧及環(huán)境對(duì)細(xì)菌多樣性有一定影響。對(duì)7 個(gè)特征條帶繼續(xù)回收和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果如表2所示。

黏豆包面團(tuán)6 個(gè)樣品中共檢測(cè)出5 種細(xì)菌，他們分別屬于4 個(gè)菌屬。食竇魏斯氏菌和腸膜明串珠菌在6 個(gè)樣品中均檢測(cè)出，且在多個(gè)樣品中條帶明亮，更寬，說(shuō)明二者無(wú)論是大黃米或江米為原料面團(tuán)中都存在很多。融合魏斯氏菌僅在大黃米和玉米混合的黏豆包面團(tuán)樣品中檢出，說(shuō)明為大黃米發(fā)酵面團(tuán)的特有菌屬。此外，乳桿菌屬中的羅氏乳桿菌、乳酸乳球菌也在黏豆包面團(tuán)中檢出。由此推斷，食竇魏斯氏菌和腸膜明串珠菌為黏豆包發(fā)酵面團(tuán)樣品中所占比例最高，屬于黏豆包的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群；且不同谷物為原料制作的黏豆包面團(tuán)可能存在獨(dú)有的特有菌屬。

從條帶分布結(jié)合鑒定結(jié)果可知，即使同一地區(qū)采集的相似原料加工的黏豆包樣品中細(xì)菌結(jié)構(gòu)也存在差異，這一發(fā)現(xiàn)與同為東北滿族谷物發(fā)酵食品“酸湯子”的細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。烏日娜等[17]發(fā)現(xiàn)遼寧丹東地區(qū)3 個(gè)不同人家的酸湯子中細(xì)菌菌群分布差異明顯，植物乳桿菌和類腸膜魏斯氏菌為酸湯子樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群。李曉紅[30]運(yùn)用傳統(tǒng)分離鑒定方法，從自然發(fā)酵小麥面粉面團(tuán)中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢(shì)菌。而對(duì)5 份中國(guó)傳統(tǒng)小麥面粉發(fā)酵面團(tuán)的高通量測(cè)序結(jié)果顯示明串珠菌屬、乳酸桿菌和魏斯氏菌屬是其中的優(yōu)勢(shì)菌屬[31]。以江米為原料的黏豆包發(fā)酵面團(tuán)中還鑒定到了作為國(guó)際公認(rèn)益生菌的羅氏乳桿菌，該菌曾在一種發(fā)酵食品Ting中分離得到，早在2003年中國(guó)衛(wèi)生部即批準(zhǔn)它為可用于人類健康的保健產(chǎn)品，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值[32-33]。

圖3 不同黏豆包樣品的細(xì)菌DGGE指紋圖譜Fig. 3 DGGE profiles of V3 fragments of bacterial 16S rDNA genes from sticky bean bun samples

2.2.2 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)中酵母菌DGGE指紋圖譜分析

圖4 不同黏豆包樣品的酵母菌DGGE指紋圖譜Fig. 4 DGGE profiles of D1 fragments of 26S rDNA genes of yeasts from sticky bean bun samples

黏豆包發(fā)酵面團(tuán)樣品中酵母菌PCR鑒定后所得對(duì)應(yīng)的DGGE圖譜及其各條帶基因測(cè)序后在NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)后的結(jié)果分別見圖4和表2。結(jié)果顯示，酵母菌DGGE圖譜中獲得5 個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)出較大的差異性，得到的條帶數(shù)量、酵母分布情況以及清晰度較細(xì)菌相比，都有較大下降。其中發(fā)現(xiàn)的誕沫假絲酵母在6 個(gè)樣品中均有條帶顯現(xiàn)，傳統(tǒng)手工家庭制作的黏豆包面團(tuán)中都發(fā)現(xiàn)了卡利比克畢赤酵母，普蘭久浩酵母中以大黃米和玉米為原料發(fā)酵的黏豆包面團(tuán)中出現(xiàn)的條帶明亮而清晰。此外在實(shí)驗(yàn)室模擬加工的黏豆包面團(tuán)里出現(xiàn)了一種不能培養(yǎng)的酵母菌。

由此推測(cè)，黏豆包面團(tuán)中的優(yōu)勢(shì)酵母菌屬為誕沫假絲酵母。不同原料發(fā)酵的黏豆包存在各自的特征條帶，暗示可能存在機(jī)會(huì)發(fā)酵菌種，專一利用特有的酵母進(jìn)行發(fā)酵，本研究中的卡利比克畢赤酵母就可能屬于其中之一。本研究還鑒定出的普蘭久浩酵母屬于耐冷酵母，黏豆包的加工多為冬天，而普蘭久浩酵母能高產(chǎn)乳糖酶，東北極冷條件下也保有很高活性。以玉米為原料發(fā)酵制成的酸湯子中的優(yōu)勢(shì)真菌也有普蘭久浩酵母。將普蘭久浩酵母的產(chǎn)低溫乳糖酶分離用于食品加工領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值[34]。陶東婭等[35]研究黑龍江牡丹江市東寧縣以大黃米-玉米質(zhì)量比3∶1的黏豆包酸面團(tuán)的真菌菌群發(fā)現(xiàn)米根霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母和異常畢赤酵母為優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同地域黏豆包面團(tuán)中細(xì)菌的多樣性比真菌的豐富。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)黑龍江省傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包面團(tuán)微生物菌群組成進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)與面團(tuán)的原料組成有關(guān)，揭示了可能在黏豆包發(fā)酵過(guò)程中起關(guān)鍵作用的菌群，了解東北地區(qū)利用傳統(tǒng)方法自然發(fā)酵的黏豆包中微生物的種類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏豆包面團(tuán)中細(xì)菌較酵母相比種類更為多樣，明串珠菌屬、魏斯氏菌和假絲酵母為優(yōu)勢(shì)菌群，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬。今后可以通過(guò)純培養(yǎng)從黏豆包中獲得相關(guān)菌株研究其功能特性，以期找出黏豆包發(fā)酵的具體功能菌，進(jìn)一步為改良黏豆包品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)黏豆包工業(yè)化、規(guī)模化、自動(dòng)化提供理論依據(jù)。