謝爽 孫燕泥 徐潤(rùn) 唐雅雪 袁平 夏歡 楊明 楊鎧瑞 唐瑜

(1.合江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 合江 646200；2.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院； 3.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；4.成都醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，四川 成都 610500)

下丘腦視前區(qū)(Preoptic area，POA)是維持哺乳動(dòng)物體溫恒定的重要中樞調(diào)節(jié)部位，視前區(qū)分布的溫度敏感神經(jīng)元通過控制皮膚血管收縮、棕色脂肪組織產(chǎn)熱和戰(zhàn)栗產(chǎn)熱，參與體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)下丘腦存在局部的谷氨酸能神經(jīng)環(huán)路[2,4,5]，谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)參與了體溫調(diào)節(jié)[6-8]。促離子型谷氨酸受體屬于配體門控離子通道，廣泛分布在神經(jīng)元突觸后膜，介導(dǎo)快興奮性突觸傳遞，主要包括N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors, AMPARs)受體。NMDA受體包括NR1、NR2和NR3三個(gè)亞基，分別由GRIN1、GRIN2A-D和GRIN3A-B基因負(fù)責(zé)編碼；作為一種異四聚體，一般由兩個(gè)NR1亞基和兩個(gè)NR2亞基組成，較少含有NR3亞基，其中NR1亞基作為NMDA受體的功能亞單位，對(duì)于維持NMDA受體的功能非常重要[9,10]。AMPA受體也是一種同/異四聚體，由GluR1-4四個(gè)亞基組成，其中GluR2亞基存在mRNA Q/R位點(diǎn)編輯，帶正電的R(精氨酸)取代Q(谷氨酰胺)，使AMPA受體對(duì)鈣離子具有較低的通透性，所以GluR2亞基在AMPA受體中的相對(duì)表達(dá)決定AMPA受體的功能特性[11,12]。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激活視前區(qū)中樞AMPA受體可以升高體溫[13]，而阻斷中樞谷氨酸促離子型受體，可以抑制外周注射精氨酸加壓素引起的低溫反應(yīng)[14]。電生理實(shí)驗(yàn)在大鼠視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元上記錄到了興奮性突觸活動(dòng)[15]，抑制這些突觸傳遞，可以影響視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元的放電和溫度敏感性，從而調(diào)節(jié)體溫[16,17]。但是這些介導(dǎo)視前區(qū)神經(jīng)元興奮性突觸傳遞的促離子型谷氨酸受體亞基尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)鑒定成年SD大鼠視前區(qū)表達(dá)的促離子型谷氨酸受體亞基，為后續(xù)研究促離子型谷氨酸受體及其亞基在視前區(qū)神經(jīng)元溫度敏感性形成機(jī)制和體溫調(diào)節(jié)中的作用奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.2 主要試劑與抗體

RNAlater、Trizol由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)；DEPC為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PrimeScript RT reagent Kit、FastStart Essential Probes Master分別購(gòu)自大連寶生物工程有限公司和Roche公司；RIPA裂解液、TEMED、PMSF為碧云天公司產(chǎn)品；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基公司；4 × loading buffer、蛋白Marker為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于Millipore公司；氯仿、異丙醇、甘氨酸、過硫酸銨、氯化鈉、戊巴比妥鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀，等均購(gòu)自成都科龍化工試劑有限公司。兔抗鼠一抗GluR1(13185)、GluR2(5306)、GluR3(4676)購(gòu)自美國(guó)CST公司；NR2A(AGC-002)、NR2B(AGC-003)為以色列Alomone公司產(chǎn)品；NR1(ab109182)、β-actin(ab8227)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(ab6721)為Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀(CFX Manager，美國(guó)Bio-Rad公司)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、純水系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、干式恒溫微量恒溫器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)、振動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)。

1.1.4 探針與引物

熒光定量PCR檢測(cè)目的基因所使用的探針選自瑞士Roche公司探針庫(kù)(UPL Probes)，所需引物為該探針庫(kù)所匹配設(shè)計(jì)的特異引物(表1)。探針成品購(gòu)自Roche公司，引物由成都梓熙擎科生物技術(shù)公司合成。

表1 目的基因探針及引物序列

1.2 方法

1.2.1 取材

腹腔注射4%戊巴比妥鈉(1 ml·Kg-1)麻醉大鼠，開顱取腦后在0.1% DEPC處理過的冰PBS液中修塊，制備含有視前區(qū)的腦組織。用振動(dòng)切片機(jī)切成300 μm厚的下丘腦片，在解剖顯微鏡下剝離視前區(qū)組織，迅速置于裝有1 ml RNAlater的EP管中。4℃過夜，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.2.1 總RNA提取

將保存于RNAlater的組織塊用無酶鑷子轉(zhuǎn)移至1 ml Trizol中，嚴(yán)格參照Trizol試劑說明書操作，獲得總RNA并溶解于15 μl無RNA酶水中，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，A260/280=1.8～2.0。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)RNA完整性，可見明亮的28S、18S及5S 3條帶，無DNA污染條帶。

1.2.2.2 cDNA合成

首先去基因組DNA，反應(yīng)體系為：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA Eraser 1 μl，總RNA 2 μg，加無酶水至總體系為10 μl，混勻離心后轉(zhuǎn)至PCR儀，42℃孵育2 min；然后在體系內(nèi)加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，該預(yù)混液含：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Primer Mix 4 μl，5×PrimeScript Buffer24 μl，RNase Free dH2O 1 μl。混勻離心后在PCR儀內(nèi)反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 sec。

1.2.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)

10 μl反應(yīng)體系：FastStart Essential Probes Master 5 μl，引物及探針各0.15 μl，2 μl cDNA，加無酶水定容為10 μl。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min；然后95℃10 sec，60℃30 sec，讀取熒光值，循環(huán)45次；最后40℃延伸30 sec。分別檢測(cè)目的基因和β-actin mRNA的臨界循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)，每個(gè)樣品均作復(fù)孔。以β-actin為內(nèi)參，使用相對(duì)定量法計(jì)算各樣本ΔCt(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)，表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)。ΔCt值越低，說明mRNA的量越多。

1.2.3 Western blot

組織塊按1 g：5 ml加入裂解液(RIPA：PMSF=100：1)，電動(dòng)勻漿后置于冰上裂解30 min，隨后4 ℃ 13000 g 10 min離心，取上清至新的預(yù)冷的EP管中。嚴(yán)格按照BCA試劑說明書進(jìn)行蛋白定量，以100 μg為標(biāo)準(zhǔn)分裝樣品，加入5 μl 4×loading buffer，定容為20 μl，渦旋震蕩混勻，100℃恒溫加熱10 min。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，使用4℃過夜的10%凝膠，電泳100 V 20 min，120 V 80 min；根據(jù)蛋白Marker指示，切下相應(yīng)范圍的膠條，轉(zhuǎn)膜，4℃ 200 mA 90 min。5%脫脂奶粉37℃封閉5 min，一抗(兔抗鼠)4 ℃震蕩過夜(NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2、GluR3 1：400，β-actin 1：5000)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗(1：5000)37℃震蕩2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，計(jì)算條帶的積分光密度值(IOD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白IOD/內(nèi)參IOD)表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有數(shù)據(jù)均以Mean±SE表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)比較樣本間均數(shù)，方差齊則采用Dunnet t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視前區(qū)NMDA受體和AMPA受體亞基mRNA的表達(dá)

如表2所示，視前區(qū)存在NMDA受體亞基Nr2a、Nr2b和Nr1 mRNA的表達(dá)，同時(shí)AMPA受體亞基表達(dá)Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但沒有檢測(cè)到Glur4。與Nr1 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Glur1(P<0.05)和Glur3(P<0.05)的mRNA表達(dá)顯著降低，而Nr2b和Nr1 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表2)。與Glur2 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Nr2b(P<0.05)、Glur1(P<0.01)和Glur3(P<0.01)mRNA的表達(dá)減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Glur1和Glur3 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。這些結(jié)果說明大鼠視前區(qū)NMDA受體亞基主要表達(dá)Nr2b和Nr1 mRNA，AMPA受體亞基表達(dá)mRNA以Glur1、Glur2、Glur3主，且Glur2表達(dá)最高。

2.2 大鼠視前區(qū)NMDA受體和AMPA受體亞基蛋白的表達(dá)

如圖1A所示，視前區(qū)存在NMDA受體亞基NR2A、NR2B、NR1和AMPA受體亞基GluR1、GluR2、GluR3蛋白表達(dá)。NMDA受體亞基蛋白NR2A與NR1相比表達(dá)明顯較少(P<0.05)；NR2B表達(dá)雖然較高，但和NR1蛋白表達(dá)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖1B)。AMPA受體亞基GluR1和GluR3蛋白相對(duì)表達(dá)高于GluR2，但只有GluR3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)GluR1、GluR2、GluR3和NMDA受體亞基蛋白NR1的表達(dá)相當(dāng)(P>0.05)，而NMDA受體亞基蛋白NR2A明顯低于AMPA受體亞基蛋白GluR2(P<0.01)，NR2B的表達(dá)正好相反(P>0.05)。這些結(jié)果說明大鼠視前區(qū)NMDA受體亞基主要表達(dá)NR2B和NR1蛋白，AMPA受體亞基蛋白主要表達(dá)GluR1、GluR2、GluR3，且GluR3表達(dá)最高。

圖1 大鼠視前區(qū)NMDA受體和AMPA受體亞基蛋白表達(dá)A：Western blot檢測(cè)大鼠視前區(qū)NMDA受體亞基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受體亞基(GluR1、GluR2、GluR3)表達(dá)的代表蛋白條帶，β-actin為內(nèi)參蛋白；B：NMDA受體亞基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受體亞基(GluR1、GluR2、GluR3)蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白/β-actin)。與NR1亞基蛋白相比，*P<0.05；與GluR2亞基蛋白相比，△P<0.05，△△P<0.01，n=6。1，2分別代表1號(hào)和2號(hào)大鼠。

目的基因Ct目的基因β-actin△CtNMDA受體Nr2a亞基31.51±0.3115.22±0.0816.40±0.31**△△NMDA受體Nr2b亞基23.32±0.0415.22±0.088.20±0.04△NMDA受體Nr1亞基22.98±0.4615.22±0.087.87±0.46AMPA受體Glur1亞基24.78±0.5115.22±0.089.67±0.51*△△AMPA受體Glur2亞基22.72±0.1915.22±0.087.61±0.19AMPA受體Glur3亞基25.09±0.4415.22±0.089.98±0.44**△△

與Nr1亞基mRNA相比較，*P<0.05，**P<0.01；與Glur2亞基mRNA相比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

下丘腦視前區(qū)參與體溫調(diào)節(jié)[1-3,18-20]，分布的溫度敏感神經(jīng)元既可以感受局部溫度變化，又可以接受外周傳入的溫度信號(hào)，故其放電活動(dòng)受到突觸傳遞的調(diào)制作用[20,21]。視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元可以控制機(jī)體的產(chǎn)熱(冷敏神經(jīng)元興奮)和散熱(熱敏神經(jīng)元興奮)活動(dòng)，這提示突觸傳入可以通過影響視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元的放電調(diào)節(jié)體溫。研究發(fā)現(xiàn)皮膚溫度信號(hào)上傳到下丘腦正中視前核的谷氨酸能中間神經(jīng)元，然后傳入到內(nèi)側(cè)視前區(qū)，視前區(qū)熱敏神經(jīng)元接受正中視前核的谷氨酸能突觸傳入后，調(diào)制視前區(qū)熱敏神經(jīng)元的放電活動(dòng)[2-5]。這說明影響視前區(qū)溫度敏感神經(jīng)元活動(dòng)的突觸傳遞可能與激活谷氨酸受體有關(guān)。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷中樞促離子型谷氨酸受體而不是促代謝型受體后，大鼠腹腔注射精氨酸加壓素引起的低溫反應(yīng)消失[14]，而直接激活視前區(qū)AMPA受體可明顯升高動(dòng)物體溫[13]。

中樞主要的谷氨酸促離子型受體包括NMDA受體和AMPA受體，廣泛分布在許多類型的神經(jīng)元上，尤其是突觸后膜。作為典型的配體門控離子通道，介導(dǎo)興奮性的快突觸傳遞活動(dòng)，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的放電頻率，放電模式，參與形成學(xué)習(xí)與記憶等方面均有重要作用。哺乳動(dòng)物神經(jīng)元上NMDA受體存在NR1、NR2和NR3三個(gè)亞基，作為一種異四聚體，一般由兩個(gè)NR1亞基和兩個(gè)NR2A-D亞基組成，較少含有NR3亞基，其中NR1亞基作為NMDA受體的功能亞單位，對(duì)于維持NMDA受體的功能非常重要[9,10]。AMPA受體是由GluR1-4四個(gè)亞基組成的同/異四聚體，其中GluR2亞基決定AMPA受體對(duì)鈣離子具有較低的通透性，它的相對(duì)表達(dá)決定AMPA受體的功能特性[11,12]。所以，在本實(shí)驗(yàn)中我們將NR1、GluR2 mRNA和蛋白表達(dá)分別作為對(duì)照進(jìn)行比較，并且用這兩亞基的表達(dá)分別代表NMDA受體和AMPA受體的功能。

采用qRT-PCR技術(shù)，在所有6只大鼠視前區(qū)都檢測(cè)到了Nr2a、Nr2b、Nr1、Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但沒有檢測(cè)到Glur4 mRNA。這也和文獻(xiàn)報(bào)道相一致，含有GluR4亞基的AMPA受體通常表達(dá)在大鼠幼年期，而在成年大鼠主要表達(dá)由GluR1、GluR2、GluR3組成的AMPA受體[9,10]。相對(duì)定量顯示，在視前區(qū)Nr2amRNA表達(dá)明顯低于Nr1，而Nr2b和Nr1 mRNA表達(dá)基本相當(dāng)；Glur1、Glur3 mRNA表達(dá)也明顯低于Glur2。采用Western blot技術(shù)，在所有6只大鼠視前區(qū)都檢測(cè)到了NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2和GluR3亞基蛋白表達(dá)。相對(duì)定量結(jié)果顯示，視前區(qū)NMDA受體亞基蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mRNA相一致，NR2A明顯低于NR1，NR2B和NR1表達(dá)基本相當(dāng)。這說明視前區(qū)NMDA受體的構(gòu)成以NR1/NR2B為主，而不是NR1/NR2A。這不同于以往的報(bào)道[15]，成年大鼠皮層、海馬以NR2A表達(dá)為主，且突觸上的NR2B蛋白表達(dá)具有年齡依賴性，海馬CA1、CA3區(qū)NR2B蛋白在出生時(shí)達(dá)到最高峰，7天后逐漸降低。海馬NR2B蛋白表達(dá)的變化與突觸可塑性密切相關(guān)，參與了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的形成[16]。NR2B亞基mRNA表達(dá)的變化可能引起腦缺血再灌注后細(xì)胞的凋亡[17]。但在視前區(qū)NMDA受體構(gòu)成以NR1/NR2B為主有何生理意義，其如何參與體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。有趣的是視前區(qū)AMPA受體亞基蛋白表達(dá)與mRNA并不一致，GluR1和GluR2表達(dá)水平相當(dāng)，GluR3表達(dá)高于GluR2。這有可能與GluR3蛋白表達(dá)升高后，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制其mRNA表達(dá)有關(guān)。一般在動(dòng)物神經(jīng)元上GluR2亞基高表達(dá)，這決定了AMPA受體對(duì)鈣離子較低的通透性[12]，從而保護(hù)神經(jīng)元避免鈣超載的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，無論是mRNA還是蛋白表達(dá)，NR1和GluR2均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而NR1是NMDA受體的功能亞基[9,10]，這提示在視前區(qū)NMDA受體和AMPA受體從表達(dá)上來看，其功能作用大體相當(dāng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平證實(shí)，在正常大鼠視前區(qū)存在促離子型NMDA受體和AMPA受體的表達(dá)，其主要亞基分別為NR1/NR2B、GluR1-3，但從受體功能上看兩種促離子型谷氨酸受體表達(dá)沒有差異。這將為后續(xù)研究促離子型谷氨酸受體及其亞基在視前區(qū)神經(jīng)元溫度敏感性形成機(jī)制和體溫調(diào)節(jié)中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。