劉澤虎 鐘燕 智慧林 桑波 李秋萍 呂聞聞 夏修蛟 沈宏

光動力治療最初用于腫瘤治療[1]。目前光動力抗感染化學療法越來越多被應用于對抗生素耐藥的細菌、病毒、原蟲及致病性真菌感染[2]。近期國內外研究表明，光動力抗感染化學療法在許多難治性或復發(fā)性的皮膚淺表及皮下深部真菌感染中取得了良好療效。中型無綠藻是導致無綠藻病的主要病原菌，而目前治療無綠藻病的主流方法依然是使用抗真菌藥物，但是治療難度非常大[3]。鑒于5-氨基酮戊酸光動力治療已取得美國食品藥品管理局和中國食品藥品監(jiān)督管理總局的批準，目前已廣泛應用于臨床，因此筆者嘗試探討該療法體外對中型無綠藻是否具有抑制作用，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株收集及鑒定 共收集7株中型無綠藻（CMCCC O22a、O22b、O22c、O22d、O22e、O22f、O22g），均由中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所中國醫(yī)學真菌保藏中心惠贈。所有無綠藻菌株通過同化試驗及26S rDNA D1/D2區(qū)序列測序鑒定到種[4]。

1.2 5-氨基酮戊酸配制 用雙蒸水避光條件下配制5-氨基酮戊酸溶液，濃度為50mmol/L。過濾去除細菌，4℃避光保存。

1.3 菌懸液制備 將菌株在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)轉種2次，以保證其純度和活力；經37℃培養(yǎng)48h的菌落，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成菌懸液；通過血球計數板計數，將菌懸液調制成（2～5）×105cfu/ml。

1.4 分組及光動力治療 參照相關文獻，實驗組分為3組[5]：T1組為1mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無綠藻37℃避光孵育30min，T2組為5mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無綠藻37℃避光孵育30min，T3組為10mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無綠藻37℃避光孵育30min，3個實驗組均接受激光照射。對照組分為3組：C1組為不加5-氨基酮戊酸溶液的中型無綠藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C2組為加5-氨基酮戊酸溶液的中型無綠藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C3組為不加5-氨基酮戊酸溶液的中型無綠藻37℃避光孵育30min后接受照射。菌懸液調制成約1×105cfu/ml，置于24孔板中。參照相關文獻，給予窄波LED（633±10）nm，LED-IB，武漢亞格光電技術有限公司），照射參數為100mW/cm2，距離為1cm，時間為20min[6]。

1.5 菌落計數法 實驗組和對照組經上述處理后，每孔取10μl，用滅菌玻璃涂布棒均勻涂于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃溫箱孵育，48～96h后待菌落形成明顯時進行計數。所有實驗每組重復3孔，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用Stata 14.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 中型無綠藻3個對照組菌落計數比較 7株中型無綠藻3個對照組菌落計數比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；經兩兩比較，C2組菌落計數均明顯低于C1組、C3組（均P＜0.05）；提示C2組單純使用5-氨基酮戊酸溶液且不照光的情況下，依然能在一定程度上抑制中型無綠藻的生長，見表1。

表1 中型無綠藻3個對照組菌落計數比較（×103cfu/ml）

2.2 中型無綠藻3個實驗組菌落計數比較 3個實驗組每株中型無綠藻生長均受到抑制，與C2組菌落計數比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。僅有3株中型無綠藻（O22a、O22c、O22d）3個實驗組菌落計數比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；另4株中型無綠藻（O22b、O22e、O22f、O22g）3 個實驗組菌落計數比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。參考國外相關文獻，筆者以C1組為參照，計算不同濃度5-氨基酮戊酸光動力處理后中型無綠藻菌生長總的受抑制率，結果為41.78%～87.82%，平均為（66.81±10.94）%。將5-氨基酮戊酸光動力處理后7株中型無綠藻生長總的受抑制率合并后進行統(tǒng)計分析，T1、T2和T3組中型無綠藻菌生長總的受抑制率分別為（59.09±10.27）%、（70.44±11.01）%和（70.90±7.12）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.17，P＜0.05）；經兩兩比較，T2、T3組中型無綠藻生長受抑制率均明顯高于T1組（均P＜0.05），T2與T3組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 不同5-氨基酮戊酸濃度光動力處理后中型無綠藻菌落計數的比較（×103cfu/ml）

3 討論

目前國內外關于無綠藻病尤其是皮膚無綠藻病的報道逐漸增多[7-13]。雖然無綠藻病尚無公認有效的治療方案，但主流方案依然是使用抗真菌藥物。臨床上無綠藻病治療失敗的現(xiàn)象很常見[3]。光動力抗感染化學療法已被成功用于各種致病性真菌感染、難治性或復發(fā)性皮膚及皮下深部的真菌感染[5-6，14-15]。

筆者通過體外試驗發(fā)現(xiàn)5-氨基酮戊酸光動力抗感染化學療法能抑制中型無綠藻的生長，而單純加5-氨基酮戊酸但不接受照射的C2組中型無綠藻的生長亦能被抑制，與國外關于致病真菌的研究結果一致[14]；筆者推測可能機制是5-氨基酮戊酸的酸性環(huán)境能抑制真菌及無綠藻的生長。與C2組比較，3個實驗組中型無綠藻的生長均受到明顯抑制，進一步證實5-氨基酮戊酸光動力治療能抑制中型無綠藻的生長。以C1組為參照，經5-氨基酮戊酸光動力處理后中型無綠藻生長總的受抑制率為41.78%～87.82%，與國外臨床資料顯示的光動力治療對致病真菌的50%～80%或更高的抑制率類似[16]。本研究結果顯示，5-氨基酮戊酸濃度為1～5mmol/L時，光動力治療抑制中型無綠藻的效應具有濃度依賴性，但超過5mmol/L后這一效應并不增強。以上體外研究結果均表明了5-氨基酮戊酸光動力治療無綠藻病尤其是皮膚無綠藻病的可能性。最近有西班牙學者通過溫熱療法聯(lián)合抗真菌藥物成功治療無綠藻病[17]。相關研究表明光動力治療不僅能直接抑制靶細胞的生長，還具有溫熱效應，進一步加強細胞毒性反應[18]。近期亦有學者發(fā)現(xiàn)光動力治療能提高抗真菌藥物的敏感性[11]，亦有研究發(fā)現(xiàn)光動力治療與氟康唑聯(lián)合使用能產生協(xié)同作用[19]，進一步表明了5-氨基酮戊酸光動力抗感染化學療法輔助抗真菌藥物用于臨床皮膚無綠藻病的前景。

5-氨基酮戊酸光動力抗感染化學療法抑制真菌的機制可能是5-氨基酮戊酸作為前體藥物，在真核細胞內轉化為原卟啉IX，在相應波長的光線照射下原卟啉IX產生單線態(tài)氧及其他自由基，從而殺傷真菌細胞。但這一療法對中型無綠藻的具體抑菌機制及作用的靶細胞器有待進一步研究，對皮膚無綠藻病的有效性也有待進一步臨床驗證。