宋雙，姜彩鴿，王國珍，樊仲慶，張怡*

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所，寧夏銀川 750002）

葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）屬卵菌門單軸霉屬，是一種專性寄生菌。無性階段產(chǎn)生孢囊梗，頂生孢子囊，內(nèi)生游動孢子。病菌的有性生殖產(chǎn)生卵孢子，于秋末在病部細(xì)胞間隙處產(chǎn)生。

由于葡萄霜霉病菌是一種寄生真菌，到目前為止在人工培養(yǎng)基（如PDA）上無法進行培養(yǎng)和保存[1]，這給在不同時間、不同地點下研究該病菌造成很大困擾。因此，有必要尋找到有效的保存菌源的方法。目前國內(nèi)外有關(guān)專性寄生菌體外保存的報道很多。如Gill等[2]報道，蠶豆霜霉病菌的分生孢子用保護劑進行處理后在-80 ℃中可保存一年，回接感病品種的葉片后，發(fā)病面積比例超過50%；Gulya等[3]報道，經(jīng)過快速冷凍干燥后向日葵和其他霜霉病菌的游動孢子囊可以在液氮中儲存4年，這種冷凍干燥技術(shù)在瓜類霜霉病的致病菌孢子囊的保存中也獲得成功，但對于玉米霜霉病菌的保存不可行[4]；Bromfield等[5]的研究表明，使用二甲基亞砜（DMSO）作為煙草霜霉病菌的冷凍保護劑，分生孢子在-180 ℃液氮中儲存25個月后仍保留其活性和感染性；郝永娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通常黃瓜霜霉病菌的孢子囊在-30 ℃條件下保存40 d以內(nèi)感染成功，并在50 d后喪失其侵染力；張艷菊等[7]認(rèn)為，黃瓜霜霉病菌的適宜儲存條件為10% DMSO加5%脫脂奶在-20 ℃預(yù)處理24 h，以這種方式儲存的孢子囊再在-70 ℃條件下保存，即使在12個月后仍然表現(xiàn)出較高的致病性；杜興蘭等[8]研究表明，使用5% DMSO作為保護劑保存葡萄霜霉菌的孢子囊，在-76 ℃條件下儲存240 d后，與對照相比沒有顯著差異。

真菌活體保存的目的是提高菌株的生存力和穩(wěn)定性，但難以保存不能在人工培養(yǎng)基上生長的寄生菌。因此，通過研究不同保護劑和保存條件，探索了葡萄霜霉病菌的較長期的保存方法，解決了葡萄霜霉菌保存時間短并且致病性降低的問題，為研究該病原菌的生物學(xué)特性、病因和預(yù)防措施奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

在金山試驗區(qū)葡萄種植基地‘赤霞珠’品種上，于病害發(fā)生期采集霜霉病菌樣品。樣品均為生長一致的單斑病葉，每片葉用報紙分隔開，裝入放有冰袋的泡沫箱中，帶回實驗室。將采回的新鮮病葉先在流水下沖洗至表面干凈（每片病葉單獨沖洗），再用裝有蒸餾水的喉頭噴霧器噴洗病葉表面，噴洗掉葉片表面殘留的霜霉病菌霉層，之后將其置于鋪有4層濕潤紗布的瓷盤內(nèi)，葉片背面朝上，用浸濕的棉花包裹葉柄，濾紙吸干葉表面殘留的水珠，用保鮮膜封口，蓋上黑布置于常溫條件（20 ℃±2 ℃）下保濕培養(yǎng)24～36 h，等到病葉上產(chǎn)生新的白色霜霉層后[9]，供保存試驗使用。

1.1.2 供試葡萄品種

金沙林場種植的高感霜霉病的品種‘紅地球’，采摘植株新生枝條的第3～5節(jié)健康葉片，用于不同保護劑、保存溫度和保存時間的霜霉病菌孢子囊接種用。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑為DMSO、液氮[10-11]和瓊脂粉，DMSO按所需的濃度配好后要先經(jīng)過滅菌再使用；所用植物培養(yǎng)箱的型號：MLR-352h-PC（日本三洋）；-20 ℃冰箱的型號：BCD-215TD GA（中國海爾）；-80 ℃超低溫保存箱的型號：DW-86L578J（中國海爾）。

1.2 方法

1.2.1 不同保護劑對葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影響

在經(jīng)過保濕培養(yǎng)后長出新霉層的病葉中，挑選具有相似形狀和霉層厚度的病斑，用無菌剪刀將病斑剪成3等份，并用3種保護劑分別保存。第一種方法是將霜霉病菌單斑放入液氮中急速冷凍，取出后再將其置于1.5 mL的塑料離心管中；第二種是將霜霉病菌單斑放入1.5 mL的塑料離心管中，再放入瓊脂粉將其埋沒；第三種方法是將霜霉病菌單斑放入1.5 mL的塑料離心管中，再用5%二甲基亞砜將其浸沒。

1.2.2 不同保存溫度對霜霉病菌孢子囊存活的影響

將用3種保護劑處理后的霜霉病菌單斑分別保存于-20 ℃和-80 ℃的低溫下，120 d后取出后進行葉盤回接，常規(guī)補水保濕，第7天調(diào)查發(fā)病情況并比較兩種低溫處理對孢子囊存活的影響。

1.2.3 不同保存時間對霜霉病菌孢子囊存活的影響

將3種保護劑處理后的霜霉病菌單斑均置于-80 ℃的超低溫冰箱保存，經(jīng)過30、60、90、120、180、360 d后取出進行葉盤回接，常規(guī)補水保濕，第7天調(diào)查發(fā)病情況并比較不同保存時間對孢子囊存活的影響。

1.2.4 接種方法

將不同保護劑、不同保存溫度和不同保存時間儲存的霜霉病菌單斑取出后，先在室溫下緩慢解凍復(fù)蘇后，再用血球計數(shù)板將孢子囊配置成8×105個/mL的懸浮液進行點滴接種，將采集回來的新鮮‘紅地球’健康葉片用蒸餾水清洗葉表面以除去灰塵和污物，在室溫條件下晾干，用直徑為15 mm的打孔器將其打成葉盤，葉背朝上置于鋪有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿（直徑為18 cm）中，每處理10個葉盤，重復(fù)3次，每皿共計30個葉盤；用微量移液器在每個葉盤的中央滴加20 μL孢子囊懸浮液。接種后用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，在18～22 ℃、濕度90%以上的黑暗處保濕培養(yǎng)24 h，之后用吸水紙吸干葉盤上殘存的菌液，繼續(xù)12 h光暗交替培養(yǎng)7 d。所有上述試驗均以相同菌株的新鮮孢子囊懸浮液接種為對照。

1.2.5 病情調(diào)查和統(tǒng)計

接種以后每天觀察發(fā)病情況，常規(guī)補水以保持葉盤濕潤；接種7 d后（葉片發(fā)病后且病情不再擴展），調(diào)查下列指標(biāo)：葉盤總面積和病斑總面積。發(fā)病情況表示為發(fā)病面積的百分比，病斑面積越大，說明其保存的效果越好。使用DPS軟件處理試驗數(shù)據(jù)并進行顯著性分析。

發(fā)病面積百分率/%＝病斑總面積/葉盤總面積×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保護劑對霜霉病菌孢子囊存活的影響

試驗結(jié)果表明（表1），3種保護劑中以5% DMSO作保護劑在-80 ℃保存效果最好，30 d后取出復(fù)蘇回接，葉盤的發(fā)病面積百分率為69.32%，與對照相比沒有顯著差異；其次是單斑病葉經(jīng)液氮快速冷凍處理后在-80 ℃保存，效果較差的是瓊脂粉包埋置于-80 ℃保存，回接葉盤發(fā)病面積百分為48.32%，與對照比具有顯著性差異。

2.2 不同保存溫度對霜霉病菌孢子囊存活的影響

試驗結(jié)果表明（表2），無論保存方法如何，在試驗的兩個低溫條件下，霜霉病菌保存的致病效果在-80 ℃都是最好的。5% DMSO浸沒保存于-80 ℃、單斑病葉經(jīng)液氮冷凍-80 ℃保存和瓊脂粉包埋-80 ℃保存，120 d后用毛筆將孢子囊刷入無菌水中進行葉盤回接，其發(fā)病面積百分率分別為58.56%、38.39%和31.97%，明顯高于-20 ℃的保存溫度。

表1 不同保護劑處理葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 1 Effects of preservation agents on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

表2 不同保存溫度下葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 2 Effect of preservation temperature on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

表3 不同保存時間下葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 3 Effect of different preservation duration on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

2.3 不同保存時間對霜霉病菌孢子囊存活的影響

將3種保護劑處理后的霜霉病菌單斑均置于-80 ℃低溫冰箱中，經(jīng)過30、60、90、120、180、360 d后取出進行葉盤回接，結(jié)果表明（表3）：3種保護劑保存的葡萄霜霉病菌孢子囊均隨著時間延長致病性明顯降低了。其中以5% DMSO處理后在-80 ℃低溫冰箱中的保存效果最佳，孢子囊的致病性能夠保持360 d以上且形態(tài)變化不大，采用該方法對上述不同保存時間的葡萄霜霉病菌孢子囊進行葉盤回接，其發(fā)病面積分別占葉盤面積的69.32%、64.58%、61.36%、58.56%、43.03%和22.96%，明顯高于液氮和瓊脂粉的保存效果。

3 討論與結(jié)論

在本研究中選擇了兩種前人研究報道過的保護劑DMSO和液氮來保存葡萄霜霉病菌的孢子囊，針對霜霉病菌孢子囊的較長期保存，成功探索出一種新的保護方式，即用瓊脂粉做保護劑。試驗結(jié)果表明，在供試的幾種保存方法中，以帶菌葉片經(jīng)5% DMSO浸沒處理后在-80 ℃低溫下保存效果最好，可以維持孢子囊的致病力達360 d以上，明顯高于在液氮和瓊脂中的保存效果，這與杜興蘭等[8]的研究結(jié)果基本一致，可以解決葡萄霜霉病菌因長期離體導(dǎo)致致病力下降的問題，分析其原因可能是由于DMSO有強烈吸濕性，能夠降低細(xì)胞冰點，減少冰晶形成，減輕自由基對細(xì)胞損害，因此可用于用于除冰劑、涂料、各種乳膠的防凍劑、汽油、航煤的防凍劑，骨髓、血液、器官低溫保存的防凍劑。

由于DMSO具有一定的毒性，高揮發(fā)性濃度可引起頭痛和頭暈，可以灼傷皮膚并引起皮膚瘙癢；液氮是一種使人窒息的氣體，低溫會對人造成凍傷，不可與皮膚接觸；所以如果是短期保存（不超過90 d）的話，推薦使用瓊脂粉，實驗室可就地取材，操作安全方便快捷，對設(shè)備要求也不高，具體使用何種保存方法，可根據(jù)實驗室情況靈活控制。

對于離體孢子囊超低溫冷凍保存試驗，有不少學(xué)者認(rèn)為，從低溫環(huán)境中取出后的解凍方式對其回接致病性存在一定影響。如Gill在研究蠶豆霜霉病菌離體保存的研究中，證明了常溫緩慢解凍對病原菌致病性影響最低[2]。因此本研究采用將孢子囊從低溫環(huán)境取出后，在室溫下緩慢融化后接種。本研究中只對孢子囊保存360 d后致病性進行了研究，今后將繼續(xù)對離體的葡萄霜霉病菌孢子囊在DMSO、液氮、瓊脂粉或其他保護劑的不同保存時間的致病性進行進一步的研究。