馬金華，王麗娟，李進(jìn)章，馬金蘭，駱玉霜，沈存芳，馬金祥，李 豪，徐曉寧

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

青海地區(qū)位于青藏高原，胃癌屬該地高發(fā)腫瘤[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)是參與缺氧應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，可以對多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并介導(dǎo)某些病理過程[3-4]?，F(xiàn)有研究證實(shí)HIF-1SNP與胃癌發(fā)病相關(guān)，HIF-2α單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與胃癌是否相關(guān)未見報(bào)道。本研究在基因水平檢測藏族健康者及胃癌患者血液HIF-2αSNP，分析兩者在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能存在的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

在青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院、青海省藏醫(yī)院，收集2014年11月～2016年12月體檢的世居青海的藏族健康者外周血62例作為對照組、45例胃癌患者外周血作為胃癌組。胃癌組男性29例，女性16例；年齡為20～79歲，平均年齡為(48.26±7.32)歲；所有患者病理分型皆為腺癌。對照組男性38例，女性24例；年齡為22～83歲，平均年齡為(46.45±6.51)歲；所有患者病理分型皆為腺癌。一般資料具有可比性(P<0.05)。本課題經(jīng)過青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀(Verity 96well，美國 ABI)，凝膠成像儀(Gene Genius，英國Syngene)，3730XL測序儀(美國 ABI)。

1.2.2 試劑

DNA marker(加拿大 BBI公司)，基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血樣標(biāo)本收集

空腹靜脈采集胃癌組和對照組成員外周血，作EDTA抗凝處理。

1.3.2 基因組DNA提取

取上述血液樣品，嚴(yán)格按照上海生工生物工程有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測其含量及純度后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)和合成

通過美國國家生物信息中心(NCBI)的GenBanb獲取HIF-2α基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息。并采用PrimerExpress 2.0軟件(美國Applied Biosystem Ine.)輔助設(shè)計(jì)引物。所有引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段大小見表 1。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，將HIF-2α rs13419896、rs7598371、rs6715787的引物分別建立25 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq buffer 2.5 μL，Taq酶(5U/μL)0.2 μL，ddH2O 14.8 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。上述反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1%瓊脂糖凝膠上電泳(100V)40 min，用溴化乙錠染色后通過凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物有限公司測序并進(jìn)行 SNP 技術(shù)分型，根據(jù)測序結(jié)果確定基因型和基因頻率。

表1HIF-2αrs13419896、rs7598371、rs6715787SNP位點(diǎn)引物序列及擴(kuò)增片段大小

Table 1The order of sequence and the size of amplification fragment

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對照組基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件，各基因型分布差異采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA電泳檢測結(jié)果

胃癌組和對照組血液做基因組DNA提取后，行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過凝膠成像儀成像，結(jié)果見圖1。

1-8：對照組，9-16：胃癌組，M：marker

圖1基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure1TheagaroseelectrophoresispictureofgenomeDNA

圖1示，基因組DNA提取成功，條帶清晰，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

以2.1所述基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2～4。

圖2HIF-2αrs13419896基因PCR擴(kuò)增圖

Figure2TheHIF-2αrs13419896genePCRamplification

圖3 HIF-2α rs7598371基因PCR擴(kuò)增圖

1-3：對照組，4-6：胃癌組，M：marker

圖2～4示，HIF-2α rs13419896、rs7598371和rs6715787位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小分別在562 bp、621 bp和513 bp處。

2.3 測序結(jié)果

圖5HIF-2αrs13419896SNP基因型圖

Figure5ThepictureofHIF-2αrs13419896SNPgenotype

圖6 HIF-2α rs7598371 SNP基因型圖

圖7 HIF-2α rs6715787 SNP基因型圖

圖5～7示，HIF-2α rs13419896 SNP基因型分別為A/A、A/G、G/G型，rs7598371 SNP基因型分別為C/C、C/G、G/G型，rs6715787 SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G型。

2.4 基因型和基因頻率在兩組中的分布結(jié)果

檢測結(jié)果示，rs13419896SNP基因型分別為A/G、G/G、A/A，rs7598371SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G，rs6715787SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G。對照組檢驗(yàn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(rs13419896SNP：χ2=3.07，P>0.05；rs7598371SNP：χ2=1.54，P>0.05；rs6715787SNP：χ2=2.28，P>0.05)。rs13419896的A/G、G/G、A/A基因型頻率在胃癌組中分別為28.89%、28.89%、42.22%，在對照組中的頻率分別為38.71%、27.42%、33.87%。rs7598371的C/G、C/C、G/G基因型頻率在胃癌組分別為26.67%、35.56%、37.78%，在對照組分別為41.94%、25.81%、32.26%。rs6715787的C/G、C/C、G/G基因型頻率在胃癌組分別為35.56%、40.00%、24.44%，在對照組分別為40.32%，32.26%、27.42%。其中rs13419896位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中A/A型最高，在對照組中A/G型最高。rs7598371位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中G/G型最高，在對照組中C/G型最高。rs6715787位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中C/C型最高，在對照組中C/G型最高，經(jīng)χ2檢驗(yàn)示，胃癌組與對照組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具體數(shù)值見表2～4。

表2rs13149896基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 2The analysis of rs13149896 genotype and allele frequency(%)

表3rs7598371基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 3The analysis of rs7598371 genotype and allele frequency(%)

表4rs6715787基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 4The analysis of rs6715787 genotype and allele frequency(%)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，青海地區(qū)藏族HIF-2α基因單核苷酸多態(tài)性與藏族胃癌易感性無關(guān)。

胃癌是青海地區(qū)高發(fā)腫瘤。有學(xué)者提出，各地區(qū)、各民族胃癌發(fā)生率不同的原因是胃癌的發(fā)生為多重基因、多種因素共同作用的結(jié)果[5]。臨床上對HIF-1α與HIF-2α的研究比較多[6]。其中，HIF-1是調(diào)節(jié)亞基，它于1992年被Semenza等人發(fā)現(xiàn)。其可調(diào)控VEGF的表達(dá)，以此控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。HIF-2α是HIF-1的功能亞基，其可識別并結(jié)合調(diào)控基因中的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)調(diào)控下游基因合成，以此調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[8-10]。HIF-2α是參與缺氧調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在生物體的正常生理調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用[11，12]。HIF-2α與胃癌的關(guān)系同樣十分密切，2010年Wang等人研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在胃癌中的作用類似HIF-1α，提示 HIF-2α在胃癌的病理階段和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[13]。因此，HIF是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療研究的熱點(diǎn)[14]。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由基因組核苷酸水平上的變異引起的，絕大多數(shù)SNPs本身雖不是易感性的原因，但在全基因組范圍內(nèi)比較易感和非易感人群之間的SNP圖譜，可顯示易感人群基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并通過關(guān)聯(lián)分析尋找易感基因。

研究青海地區(qū)藏族HIF-2α基因rs13419896、rs7598371、rs6715787位點(diǎn)的多態(tài)性以及它們與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性具有重要意義。若能明確它們的相關(guān)性，便可以為高危人群提供預(yù)警信號[15]。本研究采用的主要研究技術(shù)為“巢式PCR-RFLP”基因分型技術(shù)，這種技術(shù)相比較于傳統(tǒng)的SNP分型技術(shù)來講，可以對任何位點(diǎn)行常規(guī)性限制內(nèi)切酶鑒定，同時該SNP分型技術(shù)利用巢式PCR技術(shù)，使得對多個位點(diǎn)同時進(jìn)行分析成為可能。而SNP分型技術(shù)只能對有酶切位點(diǎn)的部位進(jìn)行切割，這就在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)對多個位點(diǎn)進(jìn)行分析。因此，即便所得的DNA濃度較低，也可以對其進(jìn)行快速的分型[16]。青藏高原為低氧環(huán)境，患者體內(nèi)的HIF-2α容易被過度激活，導(dǎo)致患者體內(nèi)的紅細(xì)胞明顯增多及組織血管生成紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致高原病的發(fā)生。而長期篩選形成的基因多態(tài)性對于藏族人群來講，可以使其適應(yīng)高原的環(huán)境，在低氧環(huán)境下亦能滿足自身的需求。有學(xué)者認(rèn)為基因多態(tài)性是對種族的正選擇。我國和日本、英國、加拿大、美國以及尼日利亞科學(xué)家共同合作創(chuàng)建了HapMap項(xiàng)目，此項(xiàng)目的主要目的是為了確定人類遺傳基因的相似性以及差異性，以此來揭示多態(tài)信息的單體型圖，探究遺傳基因的奧秘。現(xiàn)階段，HapMap標(biāo)簽單核苷酸分布(SNPs)數(shù)據(jù)已然成為了科研中的參考數(shù)據(jù)之一。在實(shí)驗(yàn)中，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，并將其信息與HapMap數(shù)據(jù)庫中的信息進(jìn)行比對，可發(fā)現(xiàn)個體差異基因與疾病之間的關(guān)系[17]。

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的相同點(diǎn)是，在生長過程中皆會出現(xiàn)局部的缺血，進(jìn)而導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足。HIFα家族轉(zhuǎn)錄因子是生物體對缺氧條件做出應(yīng)答的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。在腫瘤中，HIF蛋白會因VHL基因的突變使其失調(diào)，這一基因的突變會阻礙VHL通過其泛素連接酶活性對HIF蛋白起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。這一觀點(diǎn)已經(jīng)在HIF-2α中得到了證實(shí)，HIF-2α是HIF的一種異構(gòu)體形式，這種形式在VHL突變型腫瘤中很容易發(fā)生上調(diào)，最近有報(bào)道稱其是腫瘤干細(xì)胞的驅(qū)動因素。然而，我們還不清楚有哪些信號傳導(dǎo)作用將干細(xì)胞的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄作用機(jī)制與腫瘤中HIF-2α調(diào)節(jié)作用機(jī)制聯(lián)系在一起[18]。

HIF-1α的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)是有氧濃度依耐性的，氧誘導(dǎo)的羥化酶的作用途徑是調(diào)節(jié)HIF-1最重要的途徑。

HIF-1α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，特別是廣為人知的HIF-2α(亦稱EPAS1)，會在腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)而且是維護(hù)腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)所必需的。然而ID2在CSCs中通過哪些途徑促進(jìn)HIF-2α在腫瘤干細(xì)胞中積累我們并不清楚。在此我們報(bào)道DYRK1A和DYRK1B激酶會對ID2上的27號蘇氨酸(Thr27)進(jìn)行磷酸化。缺氧條件會通過使DYRK1A和DYRK1B的失活而使這種磷酸化作用降低。這些激酶的活性會在常氧的條件下通過對氧具有感知作用的脯氨酰羥化酶PHD1(亦稱EGLN2)被激活。ID2會與VHL泛素連接酶復(fù)合物結(jié)合，取代與VHL有相關(guān)性的Cullin 2，對HIF-2α的泛素化和降解作用進(jìn)行破壞。由DYRK1對ID2的Thr27的磷酸化作用會阻斷ID2與VHL的相互作用，從而維護(hù)HIF-2α的泛素化作用[19]。

綜上所述，探究藏族HIF-2α基因位點(diǎn)的多態(tài)性以及它們與胃癌的相關(guān)性具有積極意義。本研究結(jié)果尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和更進(jìn)一步的分型人群確認(rèn)。