王睿智，任立汆，加楊娥，燕華玲#

(1.青海大學附屬醫(yī)院皮膚科；2.西藏民族大學附屬醫(yī)院；3.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院)

對黑果枸杞多糖(LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide)的研究主要集中在其抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等方面[1-3]。本文通過觀察經(jīng)黑果枸杞多糖處理過的HaCaT細胞，及其對UVB輻射后的增殖活力和p16蛋白表達水平的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

黑果枸杞，經(jīng)青海大學藥理教研室鑒定，為柴達木野生黑果枸杞。HaCat細胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG二抗購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；p16(Abcam，ab51243)單克隆抗體購自英國abcam公司；ECL化學發(fā)光試劑檢測試劑盒購自北京Solarbio科技有限公司；飛利浦TL20W/12紫外線UVB燈管購自上海杰圖商貿(mào)有限公司；UVB輻照度監(jiān)示器購自臺灣路昌公司；X-Mark型BIO-RAD酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.2 HaCaT細胞的培養(yǎng)及分組：將細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中(37℃、5% CO2)培養(yǎng)，細胞達90%融合度時，將HaCaT細胞隨機分為3組，對照組：不接受UVB輻射；UVB輻射組：予30 mJ/cm2的UVB輻射；UVB組(30mJ/cm2)+黑果枸杞多糖組：加入黑果枸杞多糖(2mg/mL)6 h后移除各組中的培養(yǎng)基，用少量PBS沖洗2次，再加入少量PBS覆蓋后進行輻射(30mJ/cm2UVB)。輻射后置于DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細胞增殖檢測：用MTS法檢測細胞增殖。每孔中加入MTS溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中，繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，在490 nm 波長處測定各孔吸光度并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 細胞活力

表1顯示，UVB輻射后細胞活性下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明UVB輻射可誘導HaCaT細胞發(fā)生凋亡。經(jīng)黑果枸杞多糖干預后的HaCaT細胞活性升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 p16蛋白表達水平

圖1及表2顯示，UVB輻射組及UVB輻射+黑果枸杞多糖組的p16蛋白表達均升高，但UVB輻射+黑果枸杞多糖組不如單純UVB輻射組明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示黑果枸杞多糖具有抑制UVB誘導的p16蛋白表達升高的作用。

Table 1HaCaT cells proliferative activity in each

☆：表示與對照組相比，UVB輻射組HaCaT細胞增殖活性下降(P<0.05)；＊：表示與UVB輻射組比較，UVB輻射+黒果枸杞多糖組的HaCaT細胞增殖活性上升(P<0.05)。

☆：Show that compared with control group，HaCaT cell proliferative activity decrease in UVB-irradiated group(P<0.05)；*：Show that compared with UVB-irradiated group，a increase in UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

1：對照組；2：UVB輻射組；3：UVB輻射+黑果枸杞多糖組

1：control group；2：UVB-irradiated group；3：UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group

圖1黑果枸杞多糖對UVB輻射誘導HaCat細胞p16蛋白表達的影響圖

Figure1TheeffectofLyciumRuthenicumMurr.polysaccharideonUVB-inrradiatedHaCatcellsp16proteinexpression

Table 2Protein expression levels of p16 in each

注：與對照組相比，UVB輻射組及UVB輻射+黑果枸杞多糖組中p16蛋白表達升高(P<0.05)；與UVB輻射組相比，UVB輻射+黑果枸杞多糖組p16蛋白表達下降(P<0.05)。

Note：Compared with control group，protein expression of p16 in HaCaT cells.increase in UVB-irradiated group，and UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05)；compared with UVB-irradiated group，a decrease in UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

圖2 各組HaCaT細胞P16蛋白的表達水平比較圖

3 討論

UVB(290～320nm)是導致皮膚光老化的最主要因素，UVB穿透能力較差。由角質(zhì)形成細胞(HaCat細胞)組成的表皮層是皮膚最外層的結(jié)構(gòu)，所以HaCat細胞即成為UVB最主要的靶細胞。長期過量的UVB輻射至皮膚表面時，被最表層的HaCat細胞吸收，并在其線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS可抑制超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性，使其清除ROS能力大大降低，進一步導致ROS堆積，造成ROS的產(chǎn)出和清除的失衡，高濃度的ROS可破壞DNA的結(jié)構(gòu)而引發(fā)DNA損傷應答[7]，或者直接調(diào)控衰老相關(guān)信號通路[8]，促進細胞衰老的發(fā)生。本研究模擬自然光照射至地面的強度(30mJ/cm2)建立細胞損傷模型。結(jié)果顯示，經(jīng)UVB輻射后的HaCat細胞增殖活性明顯降低，推測UVB輻射HaCat細胞后發(fā)生氧化應激(reactive oxygen )，產(chǎn)出大量ROS引發(fā)了DNA損傷應答機制，導致細胞周期停滯，抑制細胞增殖。本研究所選生長在青海省柴達木盆地的黑果枸杞富含豐富的黑果枸杞多糖。與普通紅果枸杞相比，黑果枸杞中多糖含量(4.201mg/g)顯著高于紅果枸杞的多糖(2.582mg/g)含量。[1]加楊娥等研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可通過上調(diào)SOD、CAT等抗氧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量及下調(diào)丙二醛(MDA)水平來降低UVB導致的過氧化現(xiàn)象，進而緩解氧化損害，提高細胞增殖活性。[9]本實驗結(jié)果顯示，預先加入黑果枸杞多糖干預的HaCat細胞增殖活性較UVB組，所受影響相對較小，提示黑果枸杞多糖可促進UVB輻射后HaCat細胞增殖。

p16蛋白由定位于9p21的INK4a/ARF基因編碼，其N端具有與細胞周期蛋白cyclin D同源結(jié)構(gòu)，能與cyclin D競爭結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependent kinase，CDK4/6)，影響CDK4/6視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb蛋白)的磷酸化及接下來轉(zhuǎn)錄因子E2F的激活，阻止細胞周期通過G1/S監(jiān)測點，使細胞周期停滯[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白的高表達并不單一地通過Rb發(fā)生作用，在應激情況下，p38基因和p16基因的表達具有相關(guān)性[9]。Ito等[10]研究表明，UVB誘導的氧化應激產(chǎn)物ROS可激活p38MAPKs信號通路，上調(diào)p16和p19ARF的表達，限制小鼠造血干細胞的自我更新能力。本實驗中，對照組僅表達少量p16蛋白，經(jīng)UVB輻射后的HaCat細胞p16蛋白表達顯著增加，黑果枸杞多糖預處理后的HaCat細胞p16蛋白表達則明顯下調(diào)，推測UVB輻射后的HaCat細胞中有大量ROS堆積，從而激活p38MAPKs信號通路，繼而上調(diào)p16蛋白表達，致其表達升高，激活CDK4/6促進Rb蛋白磷酸化使HaCat細胞有絲分裂停滯在G1/S期，加速細胞衰老進程。此結(jié)果與劉凌[11]等研究結(jié)果一致。黑果枸杞多糖可能通過抑制氧化應激反應清除ROS堆積，同時阻斷p38MAPKs信號通路，下調(diào)p16蛋白表達，從而達到減輕光老化的目的。

綜上所述，黑果枸杞多糖可對抗UVB對HaCat細胞造成的光老化損傷，并通過下調(diào)p16蛋白的表達提高細胞增殖活性。