王 剛，羅文娟，冶 娟， 燕華玲

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，西寧 810001)

近年來(lái)對(duì)柴達(dá)木黑果枸杞的研究主要集中在抗氧化方面。本研究探討柴達(dá)木黑果枸杞原花青素對(duì)皮下注射5%D-半乳糖(D-gal)聯(lián)合紫外線(長(zhǎng)波紫外線UVA+中波紫外線UVB)照射后小鼠皮膚抗氧化作用及炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF及KM雌鼠50只，45日齡，體重18～22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：0001209。

1.2 主要試劑與儀器

柴達(dá)木黑果枸杞原花青素粉末(西安瑞林生物公司)，水溶性維生素E粉末、D-半乳糖(北京索萊寶生物公司)，SOD、GSH、CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠IL-1、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試盒(武漢基因美生物科技有限公司)。infinite M200PRO酶標(biāo)儀(TECAN公司)，紫外線輻照儀(北京精密儀器有限公司)，UVA、UVB燈管(峰波長(zhǎng)值分別為340、313nm，南京卡知電子科技有限公司)，DU800分光光度計(jì)(BECKMAN COULTER公司)，手持勻漿儀(無(wú)錫沃信儀器有限公司)，BB150二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，SIGMA 3K15離心機(jī)(SIGMA公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及脫毛

將50只小鼠隨機(jī)分為5組：正常組，模型組，維生素E組，原花青素低劑量組，原花青素高劑量組。剪去小鼠頸背部長(zhǎng)毛，用雙蒸水和75%酒精為溶媒配置4%的硫化鈉溶液，均勻涂抹于頸背部毛發(fā)上，范圍約2 cm×3 cm，待毛發(fā)略透明呈淡黃色后(約6～8min)，用棉球擦去毛發(fā)、流動(dòng)溫水沖洗。

1.3.2 模型的建立

除正常組外，其余組以5% D-gal于頸背部皮下注射(10mL/kg·d)，隔日進(jìn)行UV照射：將UVA、UVB燈管各一支平行安插在自制照光箱中，距鼠約40 cm高處，以最小紅斑量開(kāi)始照射，照射前預(yù)熱燈管15 min，照射40 min，隔日1次，持續(xù)造模40 d(UVA累計(jì)輻照劑量為98.4J，UVB累計(jì)輻照劑量為78.4J)。正常組小鼠在室溫光照下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)始至第11天按分組給予不同溶液灌胃(3mL/只·天)：維生素E組給予維生素E(50mg/kg·d)，原花青素低劑量組給予低量原花青素(50mg/kg·d)，原花青素高劑量組給予多量原花青素(100mg/kg·d)，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.3 取材及10%組織勻漿的制備

造模第41天，對(duì)小鼠行腹腔麻醉，冰上快速取下頸背部造模處皮膚組織，鈍性剝除皮下脂肪及其他結(jié)締組織，漂洗，拭干，精密稱重，置于試管中，加入9倍預(yù)冷生理鹽水，在冰水浴中勻漿，制備組織勻漿(10%)，離心(3500r/min)15 min，取上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè)

嚴(yán)格參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)以酶生化法檢測(cè)皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX、CAT活力，用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IL-1、IL-6含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織上清液SOD、CAT活力及GSH-PX含量的改變

模型組SOD、CAT活力和GSH-PX含量較正常組降低(P<0.05)；與模型組相比，經(jīng)維生素E及原花青素灌胃后皮膚組織上清液中的SOD、CAT活力和GSH-PX含量有不同程度升高(P<0.05)；原花青素低劑量組和高劑量組SOD、CAT活力和GSH-PX含量較維生素E組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

Table 1Comparison of the contents of SOD，CAT and GSH-PX among different

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與維生素E組比較，P<0.05。

2.2 各組IL-1和IL-6含量的變化

模型組IL-1、IL-6含量較正常組升高(P<0.05)；維生素E組、原花青素低劑量組、原花青素高劑量組的IL-1、IL-6含量較模型組有不同程度的降低(P<0.05)；原花青素低劑量組、高劑量組IL-1、IL-6含量較維生素E組降低幅度更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2 表2

Table 2Comparison of the skin contents of IL-1 and IL-6 among in different

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與維生素E組比較，P<0.05。

3 討論

皮膚老化按其來(lái)源可分為內(nèi)源性和外源性老化兩種形式[1]。內(nèi)源性老化受基因調(diào)控，取決于細(xì)胞的自然老化過(guò)程。外源性老化主要受外界因素的影響，其中最主要因素是紫外線輻射。紫外線是波長(zhǎng)為100～400 nm的一組光源，按波長(zhǎng)可分為長(zhǎng)波紫外線(UVA 320～400nm)、中波紫外線(UVB 280～320nm)、短波紫外線(UVC 100～280nm)。平流層的臭氧可吸收波長(zhǎng)小于290 nm的紫外線，因此真正能夠到達(dá)皮膚表皮的是UVA和UVB[2]。本研究以小鼠為研究對(duì)象，采用5% D-gal連續(xù)皮下注射聯(lián)合UV照射小鼠頸背部脫毛區(qū)域，共同建立小鼠皮膚衰老模型，綜合內(nèi)、外源性因素共同作用導(dǎo)致皮膚老化，全面的模擬皮膚衰老的真實(shí)自然狀態(tài)。

正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，機(jī)體即表現(xiàn)出氧化損傷，其中SOD、GSH、CAT等抗氧化酶反映了機(jī)體抗氧化水平。既往研究表明，長(zhǎng)期大量注射D-半乳糖及輻射過(guò)量的紫外線均可促使機(jī)體生成許多活性氧(ROS)，攻擊體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化與抗氧化反應(yīng)失衡，使得體內(nèi)抗氧化酶消耗增多、含量降低、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物蓄積[3-4]。ROS的蓄積可導(dǎo)致細(xì)胞組成成分如細(xì)胞膜、線粒體、DNA氧化損傷，激活細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體[5-6]。相關(guān)研究表明，UV照射可激活NF-kB通路和AP-1的表達(dá)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1B、TNF-a、IL-6、IL-8及各種黏附因子的表達(dá)，這些炎性細(xì)胞因子的激活進(jìn)一步擴(kuò)大NF-kB通路和AP-1的表達(dá)，增強(qiáng)UV對(duì)皮膚的損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)5%D-半乳糖聯(lián)合UV(UVA+UVB)照射后，模型組皮膚組織上清液中SOD、CAT活力值及GSH含量值明顯下降，IL-1、IL-6含量升高，說(shuō)明UV和D-半乳糖可破壞機(jī)體的酶防御系統(tǒng)，上調(diào)炎癥因子IL-1、IL-6的表達(dá)，造成機(jī)體的損傷，加速皮膚的老化。給予原花青素、維生素E灌胃處理后皮膚組織上清液中SOD、CAT活力和GSH含量值與模型組相比有不同程度的升高，IL-1、IL-6的表達(dá)均明顯下降；且原花青素低、高劑量組較維生素E組效果更明顯。說(shuō)明黑果枸杞原花青素及維生素E均可保護(hù)小鼠機(jī)體的酶防御系統(tǒng)，不同程度地提高機(jī)體抗氧化損傷的能力，增加體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的活性和含量，降低炎癥因子的表達(dá)，減輕對(duì)小鼠皮膚的損傷，延緩皮膚衰老。黑果枸杞原花青素的抗老化效果顯著高于維生素E，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。

綜上所述，柴達(dá)木黑果枸杞原花青素及維生素E均能減輕D-半乳糖和紫外線對(duì)小鼠皮膚的損害，減緩小鼠皮膚衰老的進(jìn)程，這與增加抗氧化酶活性及含量，同時(shí)下調(diào)IL-1、IL-6的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以青海地區(qū)自然環(huán)境及本地藥物資源為出發(fā)點(diǎn)，為青海柴達(dá)木黑果枸杞原花青素的抗老化作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因本實(shí)驗(yàn)研究條件有限，未做深入研究。下一步擬從基因表達(dá)、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面開(kāi)展研究。