付 玉，王文迪，許蘇旸，蘇全生

大強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)可引起動(dòng)物、人體出現(xiàn)淋巴細(xì)胞凋亡[1]。細(xì)胞凋亡是一種生理性細(xì)胞程序化死亡，通常對(duì)機(jī)體有積極影響。在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基水平會(huì)隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增大而增加，易誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞，出現(xiàn)免疫力及運(yùn)動(dòng)能力下降。

黃精(polygonatum sibiricum Red)是我國(guó)中醫(yī)傳統(tǒng)常用藥物之一[2]。黃精多糖為黃精的主要生物活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、調(diào)血脂、抗缺氧性細(xì)胞壞死和抗菌等作用[3]。然而，目前在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域涉及黃精多糖的相關(guān)研究較少，且極少見人體實(shí)驗(yàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察黃精多糖對(duì)一次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)前后被試外周血淋巴細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)因子凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2， Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白Bax (Bcl-2 Associated X Protein)、凋亡相關(guān)因子(Fas)、凋亡相關(guān)因子配體(FasL)的變化，探討其對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞凋亡的影響，并分析其作用機(jī)制，為黃精多糖有效合理利用理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

于成都體育學(xué)院招募健康狀況良好、無(wú)系統(tǒng)專業(yè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練經(jīng)歷、無(wú)吸煙史的男性大學(xué)生作為被試，并要求其在實(shí)驗(yàn)期間避免服用任何藥物和進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)。受試者簽署知情同意書后納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理因素

將14名被試隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)和實(shí)驗(yàn)組(B組)。基本情況見表1。

表1 兩組被試基本情況

黃精多糖腸溶膠囊(90%純度，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)組1 g/d劑量口服黃精多糖(實(shí)驗(yàn)劑量以《中華人民共和國(guó)藥典》為參考依據(jù)計(jì)算得出[4])，對(duì)照組口服同等劑量的安慰劑(填充糊精的膠囊)，連續(xù)4周。

1.3 一次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)[5]

適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)：受試者在坡度為0°的跑臺(tái)上以5 km/h速度運(yùn)動(dòng)5 min后休息3 min。

正式運(yùn)動(dòng)：維持跑臺(tái)坡度為0°，運(yùn)動(dòng)全程監(jiān)控受試者心率，運(yùn)動(dòng)時(shí)間及距離。將5 km/h作為運(yùn)動(dòng)起始速度，以后每3 min速度增加2 km/h，提速同時(shí)測(cè)量受試者RPE等級(jí)，直至速度達(dá)到15 km/h或受試者心率達(dá)170 /min不再增加，保持該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度至力竭(大汗，呼吸困難，動(dòng)作出現(xiàn)明顯不協(xié)調(diào)，心率保持180 次/min以上，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度自覺(jué)量表RPE達(dá)19～20，反復(fù)鼓勵(lì)仍不能堅(jiān)持)即終止。

1.4 測(cè)試樣本采集

分別于運(yùn)動(dòng)前與運(yùn)動(dòng)后即刻于肘正中靜脈抽取受試者血液樣本5 mL，接入肝素抗凝管。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.5.1 儀器與試劑

BD公司的流式細(xì)胞分析儀(CoulterEPICS ELITE ESP)，F(xiàn)as-PE、FasL-PE試劑，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司Annexin-V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司Anti-bcl-2/FITC、Anti-bax/FITC試劑。

1.5.2 淋巴細(xì)胞凋亡率與Fas、FasL測(cè)定

淋巴細(xì)胞懸液制備：①將裝于肝素抗凝管內(nèi)的5 ml血液樣本取4 ml肝素鈉抗凝血，通過(guò)4 ml Hank’s液(pH 7.2～7.6)稀釋1倍；②將8 ml淋巴細(xì)胞分離液預(yù)先置于另一20 ml無(wú)菌離心管內(nèi)，毛細(xì)吸管取稀釋血液，分離液面上1 cm處，沿管壁徐緩加入，使稀釋血液在分離液面上形成清晰界面，1 000 r/min離心10 min；③離心后，用毛細(xì)吸管輕輕將呈白色云霧狀的集中于血漿層和分離液層間的淋巴細(xì)胞吸出，移進(jìn)另一無(wú)菌EP管內(nèi)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，RPMI1640洗滌2次，每次1 500 r/min離心10min，棄上清；④RPMI1640(含5%小牛血清)重懸沉淀，調(diào)制成1-2×106個(gè)/ml淋巴細(xì)胞懸液待用。

淋巴細(xì)胞凋亡率：加入Annexin V-FITC 5 μL 標(biāo)記，再加入 Propidium Iodide(PI)5μL 標(biāo)記，混勻，進(jìn)行避光反應(yīng)10 min(室溫條件下)，加入400 μL Binding Buffer液，并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Fas、FasL：將20 μL 1:50稀釋的Fas-PE、FasL-PE熒光標(biāo)記抗體加入淋巴細(xì)胞懸液中，進(jìn)行遮光30 min反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)分析每管樣本10 000個(gè)細(xì)胞中Fas、FasL蛋白表達(dá)率。

1.5.3 Bcl-2、Bax測(cè)定

淋巴細(xì)胞分離后，1 000 rpm/min離心10 min，PBS洗滌2次，加入2%多聚甲醛固定40 min，之后以相同轉(zhuǎn)速再離心5 min，棄上清，PBS洗滌一次，加入破膜劑后再離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，加入20 μL 1:50稀釋的Anti-bcl-2/FITC、Anti-bax/FITC熒光標(biāo)記抗體，遮光30 min反應(yīng)，用流式細(xì)胞儀分析每管樣本10 000個(gè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

使用SPSS 17.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用獨(dú)立樣本和配對(duì)樣本T檢驗(yàn)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組被試運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、最大心率比較

如表2所示，兩組被試運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及最大心率比較無(wú)顯著性差異。

表2 兩組被試運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、最大心率比較

2.2 細(xì)胞凋亡率比較

如表3所示，兩組淋巴細(xì)胞凋亡率在運(yùn)動(dòng)前組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與運(yùn)動(dòng)前相比，兩組凋亡率在運(yùn)動(dòng)后即刻均顯著升高(P<0.01)，但B組凋亡率升高幅度明顯低于A組(P<0.05)。

表3 兩組運(yùn)動(dòng)前后淋巴細(xì)胞凋亡率變化情況

注：與運(yùn)動(dòng)前相比，▲，P<0.01；與A組相比，◆，P<0.05。

圖1兩組運(yùn)動(dòng)前后細(xì)胞凋亡率表達(dá)

Figure1ExpressionoflymphocyteapoptosisinGroupAandB

2.3 Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax比較

如表4所示，運(yùn)動(dòng)前兩組間Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)動(dòng)后即刻，兩組Bcl-2表達(dá)、Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)，但B組Bcl-2/Bax降低幅度明顯低于A組(P<0.05)，Bax表達(dá)顯著增加(P<0.01)；此外，與A組相比，B組Bcl-2、Bax水平雖無(wú)明顯差異(P>0.05)，但Bax水平有降低趨勢(shì)，Bcl-2水平有升高趨勢(shì)。

圖2兩組運(yùn)動(dòng)前后Bax表達(dá)

Figure2ExpressionofBaxinGroupAandBbeforeandafterthetraining

圖3兩組運(yùn)動(dòng)前后Bcl-2表達(dá)

Figure3ExpressionofBcl-2inGroupAandBbeforeandafterthetraining

2.4 Fas、FasL比較

如表5顯示，運(yùn)動(dòng)前兩組間Fas、FasL表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)后即刻，兩組Fas表達(dá)較運(yùn)動(dòng)前均顯著升高(P<0.01)，但B組升高幅度明顯低于A組(P<0.05)，而FasL水平變化較運(yùn)動(dòng)前并不顯著(P>0.05)；此外，與A組相比，B組FasL水平雖無(wú)明顯差異(P>0.05)，但FasL水平有降低趨勢(shì)。

圖4兩組運(yùn)動(dòng)前后Fas表達(dá)

Figure4ExpressionofFasinGroupAandBbeforeandafterthetraining

表4 兩組運(yùn)動(dòng)前后Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax變化情況

注：與運(yùn)動(dòng)前相比，▲P<0.01； 與運(yùn)動(dòng)后A組相比 ，◆P<0.05

表5 兩組運(yùn)動(dòng)前后Fas、FasL變化情況

注：與運(yùn)動(dòng)前相比，▲P<0.01；與運(yùn)動(dòng)后A組相比 ，◆P<0.05

圖5兩組運(yùn)動(dòng)前后FasL表達(dá)

Figure5ExpressionofFasLinGroupAandBbeforeandafterthetraining

3 分析與討論

3.1 一次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，區(qū)別于細(xì)胞壞死，細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)過(guò)程，通常對(duì)機(jī)體有積極影響，但大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)易導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)程度不一的損傷，并和細(xì)胞損傷以及機(jī)體運(yùn)動(dòng)性疲勞緊密相關(guān)[6]。有動(dòng)物研究表明[7]，無(wú)論2次力竭、1次力竭、還是中等強(qiáng)度訓(xùn)練，Wistar大鼠胸腺細(xì)胞DNA均呈現(xiàn)梯帶電泳這一典型的凋亡特點(diǎn)，丁海麗報(bào)道了一次性大負(fù)荷游泳后大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較安靜時(shí)顯著升高[8]。湯靜[9]報(bào)道了普通大學(xué)生完成一次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后即刻淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)受試者連續(xù)給藥4周后進(jìn)行一次大強(qiáng)度遞增跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，結(jié)果顯示，與運(yùn)動(dòng)前相比，安慰劑組與黃精多糖組運(yùn)動(dòng)后即刻凋亡百分比均顯著增加(P<0.01)，與前人研究結(jié)果一致，這一結(jié)果也就佐證了本研究關(guān)于30 min大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)顯著誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Fas上調(diào)；Bcl-2下調(diào)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但黃精多糖組凋亡率明顯小于安慰劑組(P<0.05)，提示黃精多糖可明顯抑制大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

3.2 黃精多糖對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后Bcl-2、Bax的影響

Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡的基因家族的基本成員之一，其家族成員根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為兩類：一是抑制凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xl等；二是促進(jìn)凋亡的蛋白，包括Bax、Bcl-xs、Bak、Bid、Bad和Bim等，而Bcl-2和Bax是其中最為重要的成員[10,11]。研究顯示，抗凋亡類蛋白與促凋亡蛋白通過(guò)形成同源或異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，若形成異源二聚體則實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的目的，有研究認(rèn)為細(xì)胞是否發(fā)生凋亡在相當(dāng)程度上是抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)Q定的，若Bcl-2和Bax二者比值升高則促進(jìn)細(xì)胞存活，反之則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。另有研究報(bào)道，急性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，Bcl-2/Bax比值降低[14]。Park等[15]發(fā)現(xiàn)12名受試者在急性離心運(yùn)動(dòng)后即刻白細(xì)胞凋亡率顯著升高，而運(yùn)動(dòng)后2 h、24 h、48 h凋亡率逐漸降低，但較運(yùn)動(dòng)前仍處于較高水平；另外，白細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯減少，而Bax蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值均顯著升高。李艷[16]研究了急性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻小鼠腎細(xì)胞Bax、Bax/Bcl-2明顯增加，而Bcl-2無(wú)明顯降低。李園等[17]等報(bào)道了一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠脾細(xì)胞Bax顯著升高，Bcl-2/Bax顯著降低。本研究結(jié)果顯示，與運(yùn)動(dòng)前相比，安慰劑組與黃精多糖組運(yùn)動(dòng)后即刻Bcl-2、 Bcl-2/Bax顯著降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。這與之前大多數(shù)研究結(jié)果一致。此外運(yùn)動(dòng)后即刻黃精多糖組較安慰劑組Bax表達(dá)水平下降，Bcl-2水平升高，表明黃精多糖能促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，并抑制Bax表達(dá)，從而減少凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果提示黃精多糖調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白之間的比例可能是其減少凋亡以保護(hù)機(jī)體的機(jī)制之一。

3.3 黃精多糖對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后Fas、FasL的影響

細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fas和FasL均屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腫瘤壞死因子家族成員[18]。目前已證實(shí)，F(xiàn)as作為死亡受體，其與配體FasL相結(jié)合是Fas在體內(nèi)發(fā)揮作用的唯一途徑，二者結(jié)合后向表達(dá)Fas的細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)[21]，一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后SD大鼠腓腸肌Fas表達(dá)較運(yùn)動(dòng)前顯著增加，且安慰劑組增加幅度明顯高于用藥組(P<0.05)。錢帥偉等人的研究顯示[22]，急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使小鼠骨骼肌Fas/FasL基因表達(dá)水平在90 min時(shí)顯著增加。Walhin等[23]選取了26名經(jīng)常鍛煉的男性受試者，隨機(jī)分為非運(yùn)動(dòng)超量消耗組和運(yùn)動(dòng)超量消耗組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)超量消耗組的Fas表達(dá)顯著升高。耿瀟等[24]報(bào)道了一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞Fas蛋白顯著增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，一次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)Fas表達(dá)水平升高，本研究結(jié)果顯示，與運(yùn)動(dòng)前相比，兩組在運(yùn)動(dòng)后即刻Fas蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，但黃精多糖組增加幅度明顯低于安慰劑組(P<0.05)，而FasL水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；此外，在運(yùn)動(dòng)后即刻，兩組FasL水平雖無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但黃靜多糖組Fas水平仍表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，提示黃精多糖可能主要通過(guò)調(diào)控Fas蛋白的表達(dá)從而保護(hù)機(jī)體，抑制淋巴細(xì)胞凋亡。

3.4 黃靜多糖抑制細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制

細(xì)胞凋亡是由系列酶參與、由基因調(diào)控的一個(gè)主動(dòng)的高度有序的死亡過(guò)程。目前，引起細(xì)胞凋亡有3條途徑介導(dǎo)：線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，前兩種為引起細(xì)胞凋亡的主要途徑，線粒體途徑中，Bcl-2與其家族成員共同形成一個(gè)極其復(fù)雜的互相作用的網(wǎng)絡(luò)，家族成員之間可形成同源或異源二聚體，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Bax和Bcl-2是最重要的代表[25]。死亡受體通路也稱外源性凋亡通路，F(xiàn)as、FasL為該途徑中的重要蛋白，兩者相互識(shí)別、結(jié)合，可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使靶細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，從而引起細(xì)胞凋亡[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、3、4、5顯示，運(yùn)動(dòng)后即刻，黃精多糖組Bcl-2/Bax水平降低幅度明顯低于安慰劑組，F(xiàn)as表達(dá)水平增加幅度明顯低于安慰劑組，兩組組間Bax、Bcl-2、FasL雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但黃精多糖組在運(yùn)動(dòng)后分別表現(xiàn)出水平降低、升高、降低的趨勢(shì)。說(shuō)明黃精多糖可能通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制淋巴細(xì)胞凋亡，由于Bax 和 Bcl-2為細(xì)胞凋亡線粒體途徑的重要蛋白，F(xiàn)as和FasL為細(xì)胞凋亡死亡受體途徑的重要蛋白，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)黃精多糖可能是通過(guò)介導(dǎo)線粒體途徑和死亡受體途徑抑制細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

黃精多糖可有效抑制大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與黃精多糖通過(guò)內(nèi)外源2條途徑調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas、FasL表達(dá)水平有關(guān)。