薛勝 李剛 李慶文 汪盛

泌尿系統(tǒng)腫瘤主要有輸尿管腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、尿道腫瘤，其中以膀胱腫瘤發(fā)生率最高[1]。根據(jù)全國流行病學調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計[2]，膀胱癌在人體各組織惡性腫瘤中處于第9位。膀胱癌的發(fā)生病因與全身其他組織腫瘤發(fā)生相似，都是多種復(fù)雜的綜合因素造成的[3]。近些年來，隨著人們對腫瘤生物學微觀方面的研究深入，越來越多的學者認為microRNA-100與腫瘤之間有密切的關(guān)系，并試圖將microRNA芯片用于膀胱癌的診斷治療中[4]。本文通過開展試驗探討了膀胱癌T24細胞在miR-100的作用下產(chǎn)生的生物學變化，報道和分析microRNA-100的相關(guān)作用機制，以便于為早期診斷以及治療膀胱癌期提供依據(jù)，現(xiàn)將實驗做出如下報告：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016年5月—2017年5月進行實驗，膀胱癌T24 細胞株（中國典藏中心：CCTCC編號：GDC078）；Invitrogen公司研發(fā)的LipofeetamineTM2000；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司研發(fā)的microRNA-100，Beyotime公司研發(fā)的MTT試劑盒；Beyotime公司研發(fā)的細胞漿蛋白抽提試劑盒；Beyotime公司研究提供的抗體；mBeyotime公司研究提供的iRNA cDNA 合成試劑盒；Beyotime公司研發(fā)的miRNA 試劑盒。

1.2 實驗方法

采取人工合成方式獲取miR-100雙鏈互補DNA 片段，之后將pSilencerTM 3．1-H1 neo 載體對應(yīng)的表達載體插入，經(jīng)過鑒定之后以此當做表達microRNA 的質(zhì)粒，用LipofeetamineTM2000（脂質(zhì)體2000）通過瞬時轉(zhuǎn)染法將miR-100高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進膀胱癌T24細胞，培養(yǎng)24小時后選擇成功轉(zhuǎn)染存活率較高的細胞系繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后用Western blot 法和RTPCR技術(shù)對細胞系中survivin、VEGF的mRNA以及蛋白表達進行檢測，采取四甲基偶氮唑藍（MTT）法對24小時、36小時、48小時和60小時下膀胱癌T24 細胞增殖變化進行分析。通過Annexin V/PI雙染色法通過流式細胞術(shù)對膀胱癌細胞T24凋亡狀態(tài)進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

本次研究涉及的數(shù)據(jù)均用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理研究，計量資料通過（±s）形式表示，采用t檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 實驗結(jié)果

Survivin蛋白表達如圖1；VEGF蛋白表達如圖2。

2.2 RT-PCR實驗結(jié)果

VEGF mRNA表達見圖3；Survivin mRNA表達如圖4。

圖1 Survivin蛋白表達

圖2 VEGF蛋白表達

圖3 VEGF mRNA表達

圖4 Survivin mRNA表達

2.3 流式細胞儀檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染miR-100后的T24細胞凋亡率較空白組和對照組增加（46.35±2.14％）,P＜0.05。細胞周期中G0/G1期細胞比率增高，見表1，2。

3 討論

表1 各組細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后測定的細胞凋亡情況

根據(jù)相關(guān)資料研究顯示[5-7]，腫瘤是從組織細胞DNA上出現(xiàn)基因突變導致的組織細胞不被約束形成的持續(xù)分裂疾病。不管是因無基因抑制能力降低還是因原癌基因活化增強引發(fā)的基因突變都會產(chǎn)生基因的異常表達，引起細胞非正常的生物學行為。已有相關(guān)研究結(jié)果顯示[8-10]，在膀胱癌組織中microRNA-100的表達下調(diào)，對microRNA-100膀胱癌抑癌基因功能進行推測，具有對蛋白survivin表達量抑制促使凋亡減少的作用，可抑制細胞凋亡功能，增加膀胱細胞凋亡[11-12]。此次數(shù)據(jù)顯示，膀胱腫瘤經(jīng)轉(zhuǎn)染的后T24細胞的survivin和VEGF蛋白顯著減少，表示microRNA-100可以基因水平上對survivin基因片段以及VEGF基因片段的正常翻譯和轉(zhuǎn)錄進行抑制譯。MTT檢查顯示，相比較于對照組和空白組，實驗組轉(zhuǎn)染后細胞的增殖被抑制的比較明顯，表示survivin、VEGF對膀胱腫瘤T24細胞增殖過程中進行參與。

表2 各組細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后測定細胞周期變化情況

綜合以上結(jié)論，采取基因檢測方法能夠早期診斷和治療膀胱癌，進一步闡述尋找膀胱癌疾病治療中將microRNA當做靶標藥物的依據(jù)。