曾 真， 李建華， 謝新平△

(1福建醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 福建 福州 350108; 2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科， 福建 福州 350005)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以高雄激素血癥、排卵障礙以及多囊卵巢為特征的病變，約困擾10%的育齡期婦女，是育齡期婦女常見的一種內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病，常導(dǎo)致女性不孕。關(guān)于PCOS的發(fā)病機(jī)制，目前尚未明確定論。臨床流行病學(xué)研究顯示，育齡期PCOS患者血清、卵泡液及卵巢組織顆粒細(xì)胞層晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)水平顯著高于正常育齡期女性，推測AGEs可能通過改變卵泡的微環(huán)境，卵泡發(fā)育進(jìn)程受阻，排卵障礙，最終導(dǎo)致女性不孕[1-3]。本研究將AGEs與人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434共同孵育，觀察細(xì)胞的凋亡情況，并探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞株 人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434(上海君瑞生物技術(shù)有限公司)。

1.2主要試劑 晚期糖基化終末產(chǎn)物牛血清白蛋白(BioVision);DMEM培養(yǎng)基和青-鏈霉素(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Annexin V凋亡檢測試劑盒(eBioscience)；生化檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗caspase-3和cleaved caspase-3抗體(Abcam);抗β-actin抗體及II抗(Santa Cruz)；高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein, HMGB1) ELISA 檢測試劑盒(Shino-Test)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d傳代 1 次，所有細(xì)胞均采用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至生長密度達(dá)到75%時用于實驗。

2.2AGEs處理細(xì)胞 用無血清的培養(yǎng)液同步化6 h，將細(xì)胞隨機(jī)分成正常對照(control)組和AGEs處理(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)組。各組分別于藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用Annexin V 和PI染色，檢測凋亡細(xì)胞比例。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，PBS洗滌細(xì)胞1次，1×Binding 緩沖液洗滌細(xì)胞1次。細(xì)胞重懸于1×Binding 緩沖液100 μL，加入Annexin V吹打混勻，室溫避光孵育15 min，1×Binding 緩沖液洗滌細(xì)胞1次，1 000 r/min離心5 min。細(xì)胞重懸于1×Binding 緩沖液200 μL，加入PI吹打混勻，流式細(xì)胞儀隨機(jī)計數(shù)10 000個細(xì)胞并計算凋亡細(xì)胞百分率。

2.4Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的水平 用PBS洗滌各組細(xì)胞，每孔加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解20 min，提取總蛋白，測定各樣本蛋白濃度，蛋白煮沸變性后，行10% SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5% BSA的TBST室溫封閉2 h，加入I抗4 ℃ 孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的 II抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑ECL A液和B液檢測，IS2000R圖像工作站成像。

2.5ELISA檢測培養(yǎng)液HMGB1的水平 收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，ELISA測定人卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HMGB1的含量。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進(jìn)行單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Kueuls檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434凋亡的影響

AGEs與卵巢顆粒細(xì)胞共同孵育24 h后，100 mg/L AGEs組和200 mg/L AGEs組人卵巢顆粒細(xì)胞早、晚期凋亡率均顯著增加，與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05),見圖1。

2 AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434中caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

AGEs與人卵巢顆粒細(xì)胞共同孵育，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組人卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;但100 mg/L AGEs組和200 mg/L AGEs組人卵巢顆粒細(xì)胞的cleaved caspase-3蛋白水平顯著增加，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。

3 AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞株COV434分泌促炎介質(zhì)HMGB1的影響

AGEs與人卵巢顆粒細(xì)胞共同孵育，100 mg/L AGEs組和200 mg/L AGEs組人卵巢顆粒細(xì)胞液培養(yǎng)上清HMGB1的蛋白分泌水平顯著增加，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見圖3。

討 論

PCOS是以持續(xù)性無排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣鞯木C合征。胰島素抵抗和糖代謝異常是PCOS的核心病理機(jī)制。AGEs是在持續(xù)高糖狀態(tài)下，體內(nèi)蛋白質(zhì)多肽、氨基酸、核酸和脂質(zhì)與還原糖經(jīng)過一系列非酶糖基化反應(yīng)(即 Maillard 反應(yīng))形成的不可逆性終末期產(chǎn)物。AGEs主要通過2條途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)：一方面通過對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的直接修飾改變其結(jié)構(gòu)和功能；二是通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合，激活絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)、核因子κB(nuclear factor-κB， NF-κB)信號通路，促進(jìn)活性氧簇和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，造成細(xì)胞毒性，導(dǎo)致機(jī)體病理性損傷[4]。本研究結(jié)果提示AGEs牛血清白蛋白誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，激活凋亡蛋白caspase-3，促進(jìn)促炎介質(zhì)HMGB1的分泌。

Figure 1. Flow cytometric detection of human ovarian granulosa cell apoptosis induced by AGEs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2. The effects of AGEs on the protein levels of caspase-3 and cleaved caspse-3 in human ovarian granulosa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的影響

卵巢顆粒細(xì)胞是支持卵細(xì)胞發(fā)育的重要細(xì)胞，影響卵泡啟動、發(fā)育、成熟及閉鎖的全過程，顆粒細(xì)胞過度凋亡會降低卵泡的發(fā)育潛能及卵母細(xì)胞質(zhì)量。大量研究數(shù)據(jù)提示PCOS的發(fā)病機(jī)制與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞促凋亡受體Fas及其配體FasL表達(dá)增加[5]。動物實驗也顯示PCOS模型大鼠卵泡中的顆粒細(xì)胞凋亡率增加[6]。本研究進(jìn)一步明確凋亡參與PCOS的發(fā)病機(jī)理。

Figure 3. The effects of AGEs on the HMGB1 protein levels in the culture supernatant of human ovarian granulosa cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3AGEs對人卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清HMGB1蛋白表達(dá)的影響

研究顯示PCOS患者機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)，也參與PCOS的發(fā)病機(jī)制[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)AGEs促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞分泌慢性晚期炎癥因子HMGB1。HMGB1在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的病理學(xué)過程中也發(fā)揮著重要作用。研究顯示HMGB1也是RAGE的配體之一[8]，故其可能通過受體RAGE增強(qiáng)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究也顯示通過分子生物學(xué)的方法上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，促進(jìn)或緩解細(xì)胞凋亡[9]。

綜合上述結(jié)果，我們推測PCOS患者體內(nèi)高水平的AGEs通過與特異受體RAGE結(jié)合，通過跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)HMGB1的分泌，引起慢性炎癥狀態(tài)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡生長停滯和卵子發(fā)育障礙。