晏春根， 朱冬芳

(紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2檢驗科, 浙江 紹興 312000)

肝臟外科手術(shù)中，常常需要肝門阻斷以控制和減少出血，當(dāng)肝臟恢復(fù)血供后不可避免發(fā)生缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制雖然復(fù)雜，但所有的病理過程都有一個共同的信號途徑——Toll樣受體信號通路，后者在缺血再灌注損傷后的級聯(lián)信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[1]。缺血再灌注損傷中雖然并不存在明顯的外源性感染，但卻有典型的非感染性炎性損傷，這可能是缺血再灌注后組織細胞釋放熱休克蛋白、脂肪酸、透明質(zhì)酸降解片斷和內(nèi)源性DNA片段等多種分子，這些分子可作為內(nèi)源性配體被Toll樣受體識別而啟動炎性應(yīng)答，產(chǎn)生致炎細胞因子，從而導(dǎo)致缺血再灌注肝損傷[2-3]。因此，調(diào)控Toll樣受體信號通路可能有助于減弱缺血再灌注的炎性損傷程度。

微小RNA(microRNA，miRNA)存在于各種生物體內(nèi)，廣泛調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖、凋亡、分化和發(fā)育。目前已鑒定的人類miRNA約600余種，調(diào)控數(shù)千種靶基因mRNA的表達，眾多的miRNA和靶基因之間形成的復(fù)雜功能網(wǎng)絡(luò)，在免疫反應(yīng)強度、時效性、細胞分化和功能調(diào)節(jié)等各環(huán)節(jié)發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-146a是參與炎性應(yīng)答最重要的miRNA之一，多項研究表明，miR-146a能減少Toll樣受體介導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路炎性細胞因子分泌[4-6]。本研究探討缺血再灌注肝損傷模型中miR-146a及Toll樣受體炎性信號分子的表達變化及其與肝損傷的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及主要試劑

72只健康雄性清潔級10～12周齡SD大鼠購于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號為SCXK(浙)2016-0037,雌雄不限，體重220 g～250 g，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食、(22±2)℃、12 h白天/黑夜循環(huán)、濕度(55±5)%的動物房飼養(yǎng)。Trizol購于Invitrogen；real-time PCR試劑盒購于Promega；Triton X-100蛋白裂解液購于Sigma；TaqMan MicroRNA檢測試劑盒購于ABI；山羊抗大鼠β-actin、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)單克隆抗體及過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG 抗體購于Santa Cruz Biotechnology；大鼠IL-6 ELISA試劑盒購于Stress Gen Biotechnologies;大鼠TNF-α ELISA試劑盒購于深圳晶美公司;其余試劑均購于上海生工公司。β-actin、TLR4、IL-6和TNF-α mRNA引物由上海生工公司合成。大鼠miR-146a與U6引物購于中國銳博公司。具體引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 實驗分組及標(biāo)本采集

SD 大鼠隨機分為3組(n=24)，即肝缺血再灌注損傷組(I/R組)、假手術(shù)組(S組)和非手術(shù)組(N組)。I/R組：用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，上腹正中切口，切開腹壁各層，分離肝十二指腸韌帶，暴露肝門部，用無創(chuàng)動脈夾阻斷門靜脈進入肝臟第1次分叉的遠端，造成約70%肝臟缺血，保留動脈夾，關(guān)閉腹腔，45 min后恢復(fù)灌注;S組：用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，開腹、再關(guān)腹，不阻斷肝葉供血; N組：大鼠正常飲食，實驗前30 min大鼠尾靜脈注入生理鹽水，不開腹。

各組大鼠處理前(0 h)及經(jīng)上述處理后2、12和24 h分別采集外周血及肝組織(各時點n=6)，檢測血漿ALT活性、TNF-α和IL-6含量及肝組織中TLR4、IL-6、 TNF-α和miR-146a mRNA及蛋白表達變化。

3 檢測方法

3.1血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)活性的測定 ALT于TMS-1024全自動生化儀檢測，操作按說明。

3.2ELISA法檢測血漿IL-6和TNF-α含量 按說明書進行操作，于波長450 nm檢測樣本吸光度(A)值，分別用IL-6和TNF-α標(biāo)準(zhǔn)液繪制曲線，從曲線中得出各組大鼠血漿IL-6和TNF-α含量。

3.3總RNA抽提和real-time PCR檢測TLR4、IL-6和TNF-α的表達水平 肝組織勻漿，Trizol抽提RNA，A-MV酶(禽類成髓纖維病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)42 ℃逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴增參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5分鐘。選取β-actin作為內(nèi)參照，TLR4、IL-6和 TNF-α的相對表達量采用 2-ΔΔCt計算。

3.4miRNA-146a檢測

3.4.1反轉(zhuǎn)錄 采用ABI公司TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和特異miRNA的莖環(huán)引物，所有操作均在冰上完成。15 μL的反應(yīng)體系包括：0.15 μL的dNTP、1.0 μL的MutiScribe Reverse Transcriptase、1.5 μL的10×Reverse Transcription Buffer、0.19 μL的RNase Inhibitor及4.16 μL的Nuclease-free Water組成的Master Mix，再加上3 μL反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物和5 μL RNA稀釋樣品。反應(yīng)條件： 16 ℃ 30 min， 42 ℃ 30 min， 85 ℃ 5 min。

3.4.2Real-time PCR 采用TaqMan MicroRNA檢測試劑盒。20 μL的反應(yīng)體系包括：1.0 μL的TaqMan MicroRNA Assay(20×)，1.33 μL的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10.0 μL的TaqMan2×Universal PCR Master Mix和7.67 μL的Nuclease-free Water。在ABI7300定量PCR儀上擴增和檢測，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，40個擴增循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)。選取 U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-146a的相對表達量采用 2-ΔΔCt計算。

3.5蛋白質(zhì)抽提及Western blot分析 肝組織加1%Triton X-100蛋白裂解液勻漿，離心，棄沉淀，上清液用冰磷酸鹽緩沖液漂洗3次，離心，棄上清液，加50 μL 95 ℃ 2×Laemmli SDS緩沖液，將樣本放沸水振蕩水浴5 min，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。將蛋白轉(zhuǎn)到尼龍膜上，將膜放入含5%脫脂牛奶的Tris-HCl緩沖液37 ℃孵育1 h。更換新鮮5%脫脂牛奶TBS溶液，加入山羊抗大鼠TNF-α (1∶2 000)、IL-6(1∶2 000)、TLR4(1∶2 000)和β-actin(1∶3 000)單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，1%脫脂牛奶TBS溶液洗膜4次，每次15 min，分別加入過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1∶2 000)室溫振蕩孵育1 h，壓片、定影、顯影、洗片。Tanon Gis 2.0軟件半定量分析TNF-α、IL-6和TLR4與β-actin灰度比值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，同一組不同時點多個均數(shù)比較采用單因素方差分析，同組內(nèi)不同時點均數(shù)兩兩比較采用q檢驗；兩組間同一時點均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，方差不齊時采用近似t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血漿ALT活性及IL-6和TNF-α含量

N組大鼠各時點血漿ALT活性及IL-6和TNF-α含量均無顯著變化;S組大鼠假手術(shù)后各時點血漿ALT活性雖然有升高，但與假手術(shù)前(0 h)比較無顯著差異，而血漿IL-6及TNF-α含量卻顯著升高(P<0.05)；I/R組大鼠在處理前的血漿ALT活性及IL-6和TNF-α含量與S組及N組比較均無顯著差異，但缺血再灌注處理后大鼠血漿ALT活性及IL-6和TNF-α含量隨時間延長逐漸增高，均顯著高于S組及N組相應(yīng)時點(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠不同時點血漿ALT活性及IL-6和TNF-α含量

#P<0.05vs0 h,**P<0.01vsS or N group.

2 各組大鼠肝組織TLR4、IL-6和TNF-α mRNA的表達

I/R組大鼠缺血再灌注后肝組織TLR4、IL-6和TNF-α的mRNA水平均較處理前(0 h)明顯升高(P<0.01)，雖然隨著缺血時間的延長，TLR4、IL-6和TNF-α mRNA表達量有所下降，但始終高于0 h(P<0.01);而S組及N組大鼠肝組織各時點相關(guān)指標(biāo)卻無明顯變化，見圖1。

3 各組大鼠肝組織TLR4、IL-6和TNF-α蛋白的表達情況

I/R組大鼠肝組織TLR4、IL-6和TNFα的表達量在缺血再灌注后各時點均較缺血再灌注前(0 h)顯著升高(P<0.01)，其中2 h與12 h 3種蛋白的表達量無顯著差異，而24 h則較2 h和12 h顯著減少 (P<0.05)；S組和N組大鼠肝組織各時點TLR4、IL-6和TNF-α的表達量無明顯變化，見圖2。

Figure 1. The liver tissue mRNA expression of TLR4, IL-6 and TNF-α at different time points in I/R (A), S (B) and N (C) groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 h.

圖1各組大鼠缺血再灌注不同時點肝組織TLR4、IL-6和TNF-α的mRNA表達

Figure 2. The liver tissue protein expression of TLR4, IL-6 and TNF-α at different time points in I/R (A), S (B) and N (C) groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 h;#P<0.05vs2 h or 12 h.

圖2各組大鼠缺血再灌注不同時點肝組織TLR4、IL-6和TNF-α的蛋白表達

4 各組大鼠肝組織miR-146a的表達

各組大鼠不同時點肝組織均有miR-146a表達，I/R組缺血再灌注前(0 h)肝組織miR-146a表達與S組和N組無顯著差異。I/R組缺血再灌注處理后各時點肝組織miR-146a表達較0 h及S組、N組各時點均明顯降低(P<0.01)，尤其12 h時點下降最為明顯；S組大鼠假手術(shù)后肝組織miR-146a雖然也有所下降，但與假手術(shù)前差異無顯著性；N組大鼠各時點肝組織miR-146a表達無顯著差異，見圖3。

討 論

缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性肝功能衰竭及影響移植肝存活的重要因素，發(fā)病機制尚未完全闡明。目前已認識到[7]，缺血再灌注中釋放的一些分子(如熱休克蛋白)可以作為內(nèi)源性配體啟動Toll樣受體炎性信號通路， TLR4 介導(dǎo)的炎性應(yīng)答是缺血再灌注肝損傷發(fā)生的重要機制。

我們在缺血再灌注肝損傷大鼠模型中檢測到，大鼠缺血再灌注后，各時點血漿ALT活性及致炎細胞因子IL-6和TNF-α含量均較缺血再灌注前明顯升高；且隨著時間延長，各指標(biāo)仍持續(xù)升高；假手術(shù)組大鼠雖然血漿IL-6和TNF-α含量有升高，但血漿ALT含量卻無明顯變化；非手術(shù)組大鼠各時點各指標(biāo)含量無顯著差異，提示缺血再灌注造成了大鼠肝組織細胞炎性損傷。實驗中我們同時檢測了各組大鼠肝組織細胞TLR4及致炎細胞因子的表達情況，結(jié)果表明，缺血再灌注后各時點大鼠肝組織TLR4、IL-6和TNF-α mRNA及蛋白的表達量均有升高，雖然隨著時間延長，各指標(biāo)表達量有下降趨勢，但均顯著高于缺血再灌注前。因此，大鼠缺血再灌注后，由于肝組織TLR4、IL-6和TNF-α mRNA及蛋白的表達升高引起了致炎細胞因子IL-6和TNF-α的釋放增多，最終導(dǎo)致肝細胞損傷。

Figure 3. The miR-146a expression in rat liver tissue at different time points in I/R, S and N groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 h;##P<0.01vsS or N group.

圖3I/R、S和N組各時點肝組織miR-146a的表達

miR-146a是第一個被發(fā)現(xiàn)的在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)控作用的miRNA，參與了先天性及獲得性免疫，在先天性免疫中主要是負調(diào)控Toll樣受體-NF-κB通路中的信號分子而抑制NF-κB活性；在獲得性免疫中，主要影響調(diào)節(jié)性T細胞的表達而發(fā)揮作用[8]。有研究報道，miR-146a的表達水平與TNF-α mRNA的含量負相關(guān)[9]；miR-146a能減少TLR4信號通路中的關(guān)鍵信號分子IRAK-1的表達，并顯著減輕腸黏膜內(nèi)皮細胞的免疫損傷[10]。研究中我們檢測到，缺血再灌注后大鼠肝組織miR-146a顯著下降，其中在缺血12 h時下降尤為明顯，缺血24小時表達量雖然較2 h、12 h表達量升高，但始終顯著低于缺血再灌注前；假手術(shù)組及非手術(shù)組大鼠各時點肝組織miR-146a表達量始終高于缺血再灌注組，然而，這2組大鼠缺血再灌注后血漿ALT、IL-6、TNF-α以及肝組織TLR4、IL-6和TNF-α mRNA及蛋白的表達量卻較缺血前無顯著變化，提示它們不存在明顯的肝組織細胞損傷。因此，大鼠肝缺血再灌注后，一方面肝組織miR-146a的表達量下降，另一方面血漿ALT活性、致炎細胞因子IL-6和TNF-α含量，以及肝組織TLR4、IL-6和TNF-α mRNA與蛋白的表達量均有升高，提示缺血再灌注可以導(dǎo)致肝組織miR-146a表達下降、激活TLR4炎癥信號通路及缺血再灌注炎性肝損傷發(fā)生，調(diào)控miR-146a的表達可能有助于減弱缺血再灌注肝損傷。