周 立， 連 輝， 王志勇

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者發(fā)生心肌結(jié)構(gòu)改變和心室舒縮功能異常的特異性心肌病，是患者致死的重要原因之一[1]。大量研究證實(shí)，心臟代謝紊亂誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷、炎癥、纖維化、微血管病變和凋亡等共同參與DCM的發(fā)生發(fā)展，其中血糖代謝異常通過(guò)晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等通路引起的氧化應(yīng)激損傷是DCM發(fā)生的始動(dòng)因素，具有抗氧化功能的各種藥物在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床治療中已展現(xiàn)出一定的保護(hù)作用[1]?？p隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)在心肌細(xì)胞的協(xié)同收縮中起著至關(guān)重要的作用，糖尿病大鼠心臟PKC通路激活可引起Cx43磷酸化和分布改變[2]。肌肽(carnosine，CAR)是由β-丙氨酸和組氨酸組成的二肽，已被證實(shí)具有抗氧化應(yīng)激、抑炎和神經(jīng)保護(hù)等廣泛藥理作用[3-5]。肌肽能拮抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡[6]，但目前尚缺乏組織和器官的相關(guān)證據(jù)。為此我們以鏈脲佐菌素(streptozotoein，STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠為模型，以心功能、心肌氧化應(yīng)激、炎癥和Cx43的表達(dá)變化為觀察指標(biāo)，初步探討肌肽改善1型糖尿病大鼠心功能的機(jī)制，為臨床糖尿病心肌病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物分組與處理

40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)為11400700256933)。將大鼠分成正常對(duì)照(control，C)組，CAR對(duì)照(control+CAR,C+CAR)組，糖尿病模型(DM)組和糖尿病CAR治療(DM+CAR)組，每組10只。其中，DM和DM+CAR組禁食12 h后按55 mg/kg 劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，3 d后測(cè)空腹尾靜脈血血糖≥16.7 mmol/L為成功模型；C+CAR和DM+CAR組腹腔注射CAR (250 mg·kg-1·d-1)，喂養(yǎng)12周。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素(Sigma)；超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成)；兔抗大鼠Cx43、PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ、PKCε和PKCδ抗體(Abcam)；Alexa Fluor 594熒光標(biāo)記驢抗兔 II 抗(Invitrogen)；化學(xué)發(fā)光劑和蛋白提取試劑盒(Beyotime)；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒(Invitrogen)；其它常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1心功能測(cè)定 各組大鼠禁食12 h后，20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉大鼠并仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。分離頸總動(dòng)脈并插管至左心室，經(jīng)BL-420生物信號(hào)采集系統(tǒng)獲取心率(heart rate，HR)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)及左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(left ventricular pressure maximum rise/fall velocity，LV±dp/dtmax)。

3.2心臟組織取材及生化指標(biāo)測(cè)定 心功能測(cè)量完畢后，麻醉狀態(tài)下快速取出心臟。切取部分左心室組織，OCT包埋后液氮速凍，用于免疫熒光染色。另取部分左心室組織液氮速凍后置于超低溫冰箱保存。心肌組織液氮研磨后冰浴下勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清液備用。參照說(shuō)明書(shū)用ELISA法測(cè)定心臟組織中SOD活性和MDA含量。

3.3免疫熒光法檢測(cè)Cx43表達(dá) 取上述液氮凍存的心肌組織用Leica CM1900冰凍切片機(jī)切片并貼至載玻片上，片厚7 μm。切片浸入含0.75% Triton的PBS溶液15 min，然后加入10%驢血清室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠Cx43抗體，4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后滴加熒光 II 抗，37 ℃溫育1 h，PBS漂洗3次，加入抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡(Nikon E80i)觀察并拍攝圖像，結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析。

3.4Western blot檢測(cè)左心室肌組織Cx43及PKC各亞型的蛋白表達(dá) 左心室肌組織用液氮研磨后加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑冰上勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%分離和5%濃縮膠，每孔上樣量50 μg，凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用封閉液室溫封閉1 h，I抗孵育濃度均為1 ∶1 000，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG (1∶1 000)室溫孵育2 h，ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描定量并分析。

3.5Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子mRNA的表達(dá) 根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明提取左心室肌總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成。采用兩步法和20 μL反應(yīng)體系在Bio-Rad CFX96熒光定量上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 3 s，59 ℃ 20 s，40循環(huán)。引物序列及反應(yīng)產(chǎn)物見(jiàn)表1。待測(cè)基因的表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

結(jié) 果

1 各組大鼠體重、心臟重量、心臟指數(shù)及血糖情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DM和DM+CAR組大鼠各死亡2只，最終有36只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。DM組和DM+CAR組大鼠消瘦明顯，與C組相比，DM組大鼠體重和心臟重量降低，血糖升高(P<0.01)；與DM組比較，DM+CAR組大鼠體重、心臟重量、心臟指數(shù)及血糖的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。

2 各組大鼠心功能的變化

各組大鼠HR的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與C組相比，DM組大鼠的心功能顯著降低，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDP顯著升高和±dp/dtmax顯著降低(P<0.01)；肌肽治療可輕度改善糖尿病大鼠心功能，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDP降低，±dp/dtmax升高(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠體重、心臟重量、心臟指數(shù)及血糖比較

**P<0.01vsC group.

表3 肌肽對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

3 肌肽對(duì)糖尿病大鼠左心室組織SOD活性、MDA含量和炎癥因子表達(dá)的影響

與C組比較，DM組大鼠左心室組織的SOD活性明顯降低(P<0.01)；與DM組比較，DM+CAR組左心室組織的SOD活性升高(P<0.05)。與C組比較，DM組大鼠左心室組織的MDA含量明顯升高(P<0.01)；與DM組比較，DM+CAR組左心室組織的MDA含量明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

與C組相比，DM組大鼠左心室組織的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均顯著升高(P<0.01)；與DM組相比，DM+CAR組大鼠左心室組織的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effects of carnosine (CAR) on cardiac superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and pro-inflammatory cytokine levels in each group. C: control group； C+CAR: control+carnosine group； DM: diabetes mellitus group; DM+CAR: diabetes mellitus+carnosine group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

圖1肌肽對(duì)糖尿病左心室超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

4 肌肽對(duì)糖尿病大鼠左心室組織Cx43蛋白表達(dá)的影響

C組和C+CAR組左心室組織Cx43多呈短桿狀和簇狀規(guī)則分布于閏盤(pán)處，與心肌纖維垂直；DM組Cx43在閏盤(pán)處分布明顯減少，多呈點(diǎn)、片狀無(wú)規(guī)則分布于細(xì)胞膜側(cè)面和細(xì)胞漿內(nèi)；與DM組比較，DM+CAR組Cx43的分布明顯改善，但閏盤(pán)處分布明顯不如C組和C+CAR組。應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，與C組相比，DM組Cx43熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，與DM組相比，DM+CAR組Cx43熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)；與C組相比，DM組Cx43在閏盤(pán)處的陽(yáng)性面積顯著降低(P<0.01)，與DM組相比，DM+CAR組Cx43在閏盤(pán)處的陽(yáng)性面積顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Western blot結(jié)果顯示，與C組相比，DM組磷酸化Cx43蛋白水平明顯升高(P<0.01)；與DM組相比，DM+CAR組磷酸化的Cx43蛋白水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。與C組相比，DM組非磷酸化的Cx43蛋白水平顯著降低(P<0.01)；與DM組相比，DM+CAR組非磷酸化的Cx43蛋白水平升高(P<0.01)，見(jiàn)圖3。結(jié)果說(shuō)明肌肽治療能明顯抑制DM大鼠心肌組織Cx43的磷酸化水平。

5 肌肽對(duì)糖尿病大鼠左心室PKC表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ和PKCθ的表達(dá)在C組、C+CAR組、DM組和DM+CAR組采用方差分析和兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與C組相比，DM組左心室PKCε的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與DM組比較，DM+CAR組PKCε的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。結(jié)果說(shuō)明肌肽治療能明顯降低DM大鼠左心室PKCε的表達(dá)。

Figure 2. The micrographs of Cx43 and the quantitative analysis of mean intensity and immunoreactive particle area of Cx43 (×40). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

圖2肌肽對(duì)糖尿病左心室Cx43表達(dá)和分布的影響

討 論

作為糖尿病患者最常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥，DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)特異性治療方法。心肌代謝紊亂誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是DCM發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，抗氧化劑在DCM病人的治療中被推薦使用[7]。近年來(lái)研究顯示，炎癥也是DCM發(fā)病的主要原因之一，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相互促進(jìn)，繼而引發(fā)心功能紊亂[8]。肌肽作為內(nèi)源性強(qiáng)抗氧化劑，還有抗炎和抗衰老等作用，對(duì)糖尿病并發(fā)的腦、腎和視網(wǎng)膜損傷有較好的療效[3-5]。然而，肌肽對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響及機(jī)制并無(wú)相關(guān)研究。本研究首次對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行探討，以期為治療DCM提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 3. The protein levels of total Cx43 and its functional phosphorylated forms. P0: unphosphorylated form of Cx43; P1 and P2: phosphorylated forms of Cx43. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

圖3肌肽對(duì)糖尿病左心室Cx43磷酸化的影響

1型糖尿病并發(fā)DCM的機(jī)制和治療研究較少。研究顯示1型糖尿病患者在兒童期即出現(xiàn)明顯的心舒張功能不全，中年發(fā)生心衰的風(fēng)險(xiǎn)大幅增加[9]，與心肌氧化應(yīng)激損傷存在正相關(guān)[10]。左心室+dp/dtmax反映左心室的收縮功能；LVEDP和-dp/dtmax反映左心室的舒張功能。本研究采用左心室插管技術(shù)檢測(cè)到1型糖尿病大鼠模型LVEDP明顯升高，±dp/dtmax降低等心功能障礙；ELISA和real-time PCR檢測(cè)到左心室組織SOD活性降低，MDA含量和炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)mRNA表達(dá)水平升高，與何玉蓮等[11]和趙云躍等[12]的研究結(jié)果類(lèi)似。在師巖等[6]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肌肽治療12周后，DM組大鼠左心室心功能有所改善，氧化應(yīng)激和炎癥明顯降低，與肌肽保護(hù)其它器官功能的報(bào)道相符[3-5]。

Figure 4. The expression of PKC isoforms in the left ventricular tissue in different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsC group;##P<0.01vsDM group.

圖4肌肽對(duì)糖尿病左心室PKC各亞型蛋白表達(dá)的影響

Cx43是心室肌中最主要的縫隙連接蛋白，呈簇狀或階梯狀排列于相鄰細(xì)胞連接處和閏盤(pán)部位，其組成的低電阻通道是心肌同步收縮和離子交換發(fā)生的基礎(chǔ)。糖尿病時(shí)Cx43的表達(dá)和分布發(fā)生改變，是DCM心律失常和心功能異常的重要病理基礎(chǔ)[2]。PKC是G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，目前已知有12種亞型，受氧化應(yīng)激、炎癥和生長(zhǎng)因子等多種因素調(diào)節(jié)。激活的PKC引起Cx43蛋白Ser368位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致通道解聚，繼而引起Cx43的表達(dá)和分布改變[13]。臨床和基礎(chǔ)研究均顯示糖尿病患者和動(dòng)物模型心肌PKC通路激活，但具體亞型尚未有結(jié)論[14]。為了進(jìn)一步探討肌肽在DCM中的保護(hù)機(jī)制，我們使用免疫熒光和Western blot檢測(cè)了肌肽對(duì)DM大鼠左心室PKC及Cx43的影響。結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的PKCα、β1、β2、δ及ε 5種亞型中，DM大鼠PKCε升高，與Lin等[15]的研究結(jié)果一致，而Liu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)PKC的以上幾種亞型均有不同程度的升高，可能由于檢測(cè)的時(shí)點(diǎn)不同，心臟處于不同的生理病理狀態(tài)有關(guān)。與C組大鼠比較，DM大鼠左心室Cx43排列紊亂，熒光強(qiáng)度及閏盤(pán)處的Cx43面積顯著降低，磷酸化的Cx43的表達(dá)升高，非磷酸化的表達(dá)降低，提示Cx43趨向于降解，心肌細(xì)胞之間的電化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)受阻；肌肽治療后DM大鼠Cx43在閏盤(pán)處的表達(dá)明顯升高，PKCε及磷酸化的Cx43表達(dá)顯著降低，說(shuō)明肌肽能改善DM大鼠心肌Cx43的表達(dá)及空間分布，進(jìn)而改善心肌間電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究表明肌肽治療能改善1型糖尿病大鼠心功能障礙，其機(jī)制可能與降低左心室氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，通過(guò)PKC通路抑制Cx43磷酸化，并改善其分布有關(guān)。綜上，本研究為肌肽在DCM中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，提示肌肽具有治療DCM的潛能，為DCM的臨床治療提供了新的思路，但由于肌肽是一個(gè)多靶點(diǎn)藥物，是否存在其它保護(hù)途徑及其機(jī)制尚需深入研究。