樸春梅，梁 會(huì)，周訓(xùn)蓉

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

榆參洗劑處方源自我院皮膚科經(jīng)驗(yàn)用方，組方為黃柏、地榆、苦參、蛇床子、冰片等，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)止癢的功效，適用于濕疹、銀屑病、丘疹性蕁麻疹、結(jié)節(jié)性癢疹、疥瘡、皮膚瘙癢癥等瘙癢性皮膚病?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃柏、地榆、蛇床子、地膚子、苦參、冰片等可降低毛細(xì)血管通透性和減輕炎性介質(zhì)的釋放，產(chǎn)生明顯的抗炎、抗過(guò)敏效應(yīng)，并對(duì)金黃色葡萄球菌等均有不同程度的抑制作用。為了更好地控制榆參洗劑的質(zhì)量，本研究中對(duì)方中黃柏、苦參2味藥材進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)方中黃柏的活性成分小檗堿（C20H18NO4）進(jìn)行含量測(cè)定，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100型高效液相色譜儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；HB－10250型超聲清洗器（功率為250 W，頻率為40 kHz，江蘇漢邦科技有限公司）；AE電子分析天平（十萬(wàn)分之一，Mettler Toledo）；98－1－B型電子控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；DZ－1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，乙醇、磷酸等均為分析純；水為超純水；國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鹽酸小檗堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110713－201212）；硅膠G、硅膠H（青島海洋化工廠，供薄層層析用）；榆參洗劑（我院自制制劑）。

2 方法

2.1 薄層色譜鑒別[1]

黃柏、苦參：取樣品10 mL，加1% 醋酸甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1.5 mL，作為供試品溶液。取缺黃柏及缺苦參的陰性模擬制劑各10 mL，同法制備陰性對(duì)照品溶液。另取黃柏及苦參對(duì)照藥材各5 g，分別加1% 醋酸甲醇50 mL，加熱回流 30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1.5 mL，作為黃柏對(duì)照藥材溶液及苦參對(duì)照藥材溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB中薄層色譜法試驗(yàn)，取黃柏對(duì)照藥材、苦參對(duì)照藥材、供試品、缺黃柏陰性對(duì)照品和缺苦參陰性對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（30∶10∶3）的下層溶液為展開(kāi)劑，置氨蒸氣飽和的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液[1]。供試品溶液色譜中，在與2種對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃柏、苦參薄層色譜圖

2.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定(HPLC法)2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB －C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0.1% 磷酸溶液（28 ∶72）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.2.2 溶液制備

精密量取樣品10 mL，置50 mL錐形瓶中，加乙醇30 mL，加熱回流處理30 min，放冷，過(guò)濾，濾液定容到50 mL，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。取缺黃柏藥材的陰性對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品1.951 mg，置 5 mL 容量瓶中，加乙腈 － 水（5 ∶1）混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含0.260 1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定。陰性對(duì)照品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，0.6，0.8，1.0 mL，分別置 2 mL 容量瓶中，加乙腈－水（5∶1）混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件，各取5 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，g/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=27 815.362X+25.344 114，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在0.013 005～0.130 050 g/L與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取同一供試品溶液10 mL，分別于 0，3，6，9，12 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果的RSD為 0.93%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密量取樣品8，10，12 mL各3份，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為 1.23 g/L，RSD為 2.94% （n=9），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱(chēng)取已知含量的樣品（鹽酸小檗堿含量為 0.264 g/L）9份，每份 5 mL，精密量?。蝗?duì)照品溶液（初始質(zhì)量濃度為 1.234 g/L）1.00，0.75，0.60 mL，精密量取，加入上述樣品溶液中（每個(gè)質(zhì)量濃度3份），依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

依法制備供試品溶液和鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜峰，測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)2。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（g/L，n=10）

3 討論

3.1 樣品處理方法

在建立鹽酸小檗堿定量方法時(shí)，分別考察了超聲提取、加熱回流提取等供試品溶液的前處理方法，結(jié)果以加熱回流提取方法較好，鹽酸小檗堿含量最高。還對(duì)提取溶劑及提取時(shí)間進(jìn)行單因素考察，最終確立了本研究中供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件選擇

榆參洗劑為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，而方中黃柏、苦參分別存在陰性干擾，主斑點(diǎn)不明顯，專(zhuān)屬性不強(qiáng)。通過(guò)多次調(diào)整及試驗(yàn)，篩選出以三氯甲烷－甲醇－水（30 ∶10 ∶3）的下層溶液為展開(kāi)劑，試驗(yàn)證明[2－4]，能同時(shí)鑒別苦參與黃柏，且斑點(diǎn)清楚明顯，分離效果好，重復(fù)性較好，均無(wú)陰性干擾，操作簡(jiǎn)便。該方法具有簡(jiǎn)易、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考依據(jù)。

由于小檗堿屬于季胺型生物堿，極性較大，為了達(dá)到良好的分離效果，本研究中采用反相色譜柱進(jìn)行分離。文獻(xiàn)[5－9]報(bào)道，曾用乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鈉（24 ∶76）、（25 ∶75），乙腈 －0.1% 磷酸（45∶55）和乙腈 －水（29 ∶71）作為流動(dòng)相，2010 年版《中國(guó)藥典（一部）》中，鹽酸小檗堿以乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鈉（38∶62）為流動(dòng)相，綜合考慮分離度、出峰時(shí)間等因素，最終選擇流動(dòng)相為乙腈－0.1%磷酸溶液（28∶72），流速為1 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。結(jié)果顯示，該條件下樣品分離效果好，且出峰時(shí)間適中。

3.3 指標(biāo)成分選擇

榆參洗劑具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于濕疹瘙癢濕熱、帶下熱淋。方中選用黃柏清熱瀉火毒，燥濕去濕熱以皮治皮，配地榆涼血解毒、消腫止痛，加強(qiáng)瀉火解毒的作用，為君藥。且鹽酸小檗堿是黃柏的主要活性成分之一[10－13]，故采用鹽酸小檗堿為指標(biāo)進(jìn)行制劑學(xué)研究。

根據(jù)本品工藝研究結(jié)果，小檗堿平均含量為0.255 g/L，從大批量規(guī)模生產(chǎn)考慮，本品每1 mL鹽酸小檗堿的含量，其限度以80%計(jì)算，小檗堿的含量為0.204 g/L，故本品的限度定為每瓶含小檗堿（C20H18NO4）不得少于20.4 mg。