姜洪波,孟婷玉,孫利偉*,田玉玲,王承訓(xùn),趙艷玲,賀 巖,黃艷智,黎偉明,李 響

(1.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130051；2.吉林省疾控中心)

杯狀病毒為杯狀病毒科單股正鏈RNA病毒，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將其分為4個(gè)屬，其中諾如病毒(NoV)和札如病毒(SaV)兩個(gè)屬主要感染人類[1]，統(tǒng)稱為人類杯狀病毒(HuCV)。HuCV在全球廣泛分布，是引起兒童及成人非細(xì)菌性急性胃腸炎的常見(jiàn)病原，自1972 年發(fā)現(xiàn)諾瓦克病毒[2]以來(lái)曾引起多次大的爆發(fā)流行[3-5]。諾如病毒是全球急性胃腸炎散發(fā)病例和暴發(fā)疫情的主要致病原，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重[6]；每年可導(dǎo)致約6.85億人次急性胃腸炎發(fā)作，近30%為5歲以下嬰幼兒，導(dǎo)致5萬(wàn)患兒死亡[7]。我們依托國(guó)家和吉林省CDC病毒性腹瀉監(jiān)測(cè)項(xiàng)目對(duì)住院腹瀉患兒HuCV感染情況進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，現(xiàn)報(bào)告長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院2013-2017年腹瀉住院患兒HuCV感染病原及臨床特點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象2013年1月-2017年12月因腹瀉住院患兒2272例。納入標(biāo)準(zhǔn)：腹瀉發(fā)病時(shí)間小于等于7天；年齡小于等于60月齡；大便以稀水樣或蛋花湯樣為主，每日排便次數(shù)≥3次；伴或不伴有嘔吐。排除標(biāo)準(zhǔn)：腹瀉大便膿血性；便常規(guī)檢出大量白細(xì)胞，或膿細(xì)胞；臨床高度懷疑細(xì)菌性腸炎者。

1.2方法參照國(guó)家疾病預(yù)防與控制中心病毒所“腹瀉監(jiān)測(cè)方案”相關(guān)方法。

1.2.1標(biāo)本的采集及處理 患兒入院當(dāng)天采集糞便標(biāo)本約5 ml,制備成10%的便懸液，-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2核酸提取 采用Geneaid 病毒核酸提取試劑盒。

1.2.3HuCV核酸檢測(cè) AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為 Promega 公司產(chǎn)品，Taq 酶、PCR反應(yīng)液、RNasin 為TaKaRa 公司產(chǎn)品；引物序列參考“腹瀉監(jiān)測(cè)方案”，序列見(jiàn)表1。①逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系25 μl，包括：10xBuffer 2.5 μl，1%BSA 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，40 U/μl RNasin 0.1 μl，10 U/μl AMV-RT 0.35 μl ，模板RNA1.5 μl，dH2O 8.05 μl。反應(yīng)條件42℃，1 h。②PCR反應(yīng)體系50 μl，包括：10xBuffer 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，混合 290H,I,J,K 引物(0.1 μg/μl)1.0 μl，5 U/μl Taq 酶0.4 μl，ddH2O 29.6 μl。反應(yīng)條件94℃ 3 min→(94℃ 1 min→58℃ 1 分 20 s→72℃ 1 min)×30→72℃ 10 min。

表1 人杯狀病毒檢測(cè)的引物序列

1.2.4結(jié)果判定 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，NoV條帶大小為 319 bp，CaV條帶大小為 331 bp。

1.2.5HuCV基因型分析 應(yīng)用核酸序列檢測(cè)及分析方法，PCR陽(yáng)性標(biāo)本送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并于NCBI GenBank中NoV和CaV標(biāo)準(zhǔn)參考株比對(duì)確定基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

患兒流行病學(xué)資料及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EpiData3.1軟件錄入，應(yīng)用Excel 2010對(duì)病例進(jìn)行描述性分析，計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示；用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HuCV檢出情況

2.1.1HuCV陽(yáng)性檢出率 2013-2017年共采集腹瀉住院患兒糞便標(biāo)本2272份,381份檢出HuCV，HuCV總陽(yáng)性檢出率16.77%；2013、2014、2015、2016和2017年不同年份HuCV 陽(yáng)性檢出率分別為17.49%(67/383)、12.28%(55/448)、13.55%(66/487)、16.75%(67/400)和22.56%(125/554)。HuCV陽(yáng)性檢出率3-4年一個(gè)高峰，而且近年有增高趨勢(shì)，如圖1。

圖1 長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV陽(yáng)性檢出率

2.1.2HuCV屬和基因型 381份HuCV ，366份為 NoV，15份為SaV；NoV基因型93.17%(341/366)為GⅡ，詳見(jiàn)表2。長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒杯狀病毒感染可見(jiàn)NoV與SaV，NoV基因分組可見(jiàn)GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ?yàn)橹鳌?/p>

表2 2013-2017年HuCV屬和基因型分布

2.2HuCV陽(yáng)性患兒流行病學(xué)特點(diǎn)

2.2.1年齡分布 381份HuCV陽(yáng)性患兒年齡最小2月齡，最大54月齡，平均年齡(15.28±10.08)月齡。長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV感染以7-12月齡組病人最多(36.76%),其次為13-24月齡組(32.28%)，≤24月齡組占陽(yáng)性患者的83.20%，詳見(jiàn)圖2。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，腹瀉住院患兒HuCV感染年齡分布存在明顯差異，χ2=13.53,P=0.019。

圖2 長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院住院腹瀉患兒HuCV年齡分布

2.2.2性別分布 在2272例腹瀉患兒中，男性1342例，其中HuCV感染占16.69%(224/1342)；女性930例，其中HuCV占16.98%(158/930)；腹瀉住院患兒HuCV感染率男女性別無(wú)明顯差異，(χ2=2.791,P=0.095)。

2.2.3城鄉(xiāng)分布 腹瀉住院城市患兒1054例，鄉(xiāng)村患兒1218例； HuCV感染城市患兒167例，鄉(xiāng)村患兒214例，腹瀉住院患兒HuCV感染鄉(xiāng)村多于城市，但無(wú)明顯差異，(χ2=1.205,P=0.272)。

2.2.4季節(jié)分布 住院腹瀉患兒HuCV感染一年四季均可發(fā)生，2013-2017年總陽(yáng)性檢出率一年有兩個(gè)高峰，1-3月和12月，不同年份檢出率有所不同，見(jiàn)圖3；連續(xù)分析2013-2017年HuCV感染情況，2013年無(wú)明顯高峰，2月和4月病例數(shù)最多；2014年2-3月、5月和12月 均出現(xiàn)高峰；2015年1月、4-5月和12月3個(gè)高峰；2016年1-3月和12月2個(gè)高峰；2017年1-3月和12月2個(gè)高峰；從2014年開(kāi)始每年12月至次年1月-3月為腹瀉住院HuCV 感染的高峰季節(jié)，見(jiàn)圖3。

圖3 長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV感染季節(jié)分布

2.3HuCV感染臨床特征

381例腹瀉住院HuCV感染患兒均有腹瀉，平均每天腹瀉(4.75±2.77)次。241例伴有嘔吐，占比為63.25%。58.79%(224/361)伴有不同程度體溫升高,其中14.44%(53/381)體溫≥38.5℃。出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀者占46.72%(178/381)；2.01%(8/381)出現(xiàn)抽搐。平均住院天數(shù)為(3.6±2.7)天。

3 討論

我國(guó)1995年首次報(bào)道腹瀉患兒糞便標(biāo)本中有NLV感染[10]。HuCV是世界范圍內(nèi)急性病毒性腹瀉的主要病原之一，是我國(guó)多數(shù)地區(qū)5歲以下小兒急性病毒性腹瀉僅次于輪狀病毒的致病源[11-13]；是部分地區(qū)腹瀉某一時(shí)間段的第一位病原[14],多地報(bào)道HuCV感染有上升趨勢(shì)[15]，這可能與近年輪狀病毒疫苗的使用有關(guān)。本研究顯示長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院2013-2017年腹瀉住院患兒HuCV 陽(yáng)性檢出率分別為17.49%、12.28%、13.55%、16.75%和22.56%,總陽(yáng)性檢出率為16.77%。長(zhǎng)春市1998-2001年HuCV 陽(yáng)性檢出率為14%[16]，2003年-2007年HuCV陽(yáng)性檢出率為18%[17]，2008-2012年HuCV陽(yáng)性檢出率14.0%[18]。HuCV陽(yáng)性檢出率3-4年一個(gè)高峰，而且近年有增高趨勢(shì)。長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒杯狀病毒感染可見(jiàn)NoV與SaV，NoV基因分組可見(jiàn)GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ?yàn)橹鳌Ｄ壳皣?guó)內(nèi)外對(duì)NoV研究較深，報(bào)道亦較多。吉林省HuCV感染也以NoV為主；SaV感染率雖然很低(3.94%)，但是呈現(xiàn)逐年增多趨勢(shì)。以往由于SaV臨床表現(xiàn)較NoV輕和SaV基因型的多樣性，受檢測(cè)方法的限制，還有SaV造成隱性感染者多極少就醫(yī)，故SaV流行情況報(bào)道相對(duì)較少。近年國(guó)外對(duì)SaV流行的報(bào)道較多[19-21],目前SaV已在多個(gè)國(guó)家的急性胃腸炎病例樣本中檢出，檢出率為1.2%-17.6%[22]。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)SaV流行情況的監(jiān)測(cè)，深入研究其基因變化，了解其感染機(jī)制和發(fā)病機(jī)理，為可能出現(xiàn)的SaV暴發(fā)疫情預(yù)測(cè)和預(yù)警。

本研究長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV感染83.20%為≤24月齡嬰幼兒，感染高發(fā)年齡段為7-12月齡組腹瀉患兒，這與國(guó)內(nèi)多家報(bào)道相同[15,23]。小兒生后母體的免疫球蛋白含量逐漸減少，6月后基本消失，此時(shí)自身的抗體水平也較低。這時(shí)對(duì)病原微生物感染抵抗力最小，易患各種病毒感染；2歲以內(nèi)嬰幼兒腸道正常菌群還沒(méi)健全，生物屏障尚未形成，故≤24月齡嬰幼兒為HuCV易感人群。HuCV感染男性略多于女性，鄉(xiāng)村略多于城市。長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院嬰幼兒HuCV感染高發(fā)季節(jié)，2013-2017年為12月至次年1-3月；與1998-2001 年[16]和2003-2007年[17]相似；而2008-2012年為1-4月[18]。以上報(bào)道顯示長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV感染發(fā)病高峰為寒冷季節(jié)。HuCV感染高發(fā)季節(jié)在成都是夏秋季[15]，廣西是8-10月[24]。提示HuAC腹瀉發(fā)病高峰不同地域存在差異。東北地區(qū)預(yù)防HuCv感染重點(diǎn)應(yīng)在寒冷季節(jié)，同時(shí)不能忽視夏秋季食源性HuCV感染的爆發(fā)流行。

長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院患兒HuCV感染的臨床特點(diǎn)是63.25%伴有嘔吐，58.79%有不同程度體溫升高。提示人們：在腹瀉患兒中2/3出現(xiàn)嘔吐和發(fā)熱時(shí)，應(yīng)警惕HuCV感染，并做相應(yīng)的檢測(cè)。長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院腹瀉住院HuCV感染患兒46.72%伴有呼吸系統(tǒng)癥狀，接近深圳報(bào)道HuCV感染42.86%有呼吸系統(tǒng)癥狀[25]；2.01%(8/381)出現(xiàn)抽搐，國(guó)內(nèi)有報(bào)道腹瀉抽搐發(fā)生率約為1.78%[26]。HuCV感染多數(shù)患兒癥狀輕、具有自限性，也有報(bào)道嬰幼兒HuCV感染出現(xiàn)多器官損害[25]等嚴(yán)重并發(fā)癥。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的檢測(cè)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，HuCV的重要性和危害性逐漸被人們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)，通過(guò)加強(qiáng)HuCV感染的基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，可為HuCV感染的預(yù)防、治療和疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。