閆天懿，徐廷雙，李 萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130033)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑囊組織炎癥和關(guān)節(jié)破壞為主要特征[1,2]。RA的病因尚不清楚，可能與免疫紊亂、遺傳、感染、環(huán)境等有關(guān)。已知當(dāng)抗原進(jìn)入人體后，激活輔助性T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等炎性因子，激活B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而分泌包括抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(CCP)在內(nèi)的大量免疫球蛋白，同時(shí)誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。Tfh細(xì)胞是一類位于淋巴濾泡的 CD4+T 細(xì)胞亞群，高表達(dá)趨化因子受體CXCR5，是淋巴濾泡趨化因子CXCL13 的受體,因此Tfh受CXCL13趨化而被募集到淋巴濾泡,從而刺激 B 細(xì)胞增殖、分化,并最終形成生發(fā)中心(GC)。Tfh細(xì)胞不但對(duì)于 GC 的形成和維持至關(guān)重要,而且還能夠維持、輔助B 細(xì)胞成熟、增殖，促使免疫球蛋白發(fā)生類別轉(zhuǎn)換[4,5]。已知CXCR5是Tfh細(xì)胞表面高表達(dá)標(biāo)志性分子，CD4+CXCR5+Tfh可代表Tfh細(xì)胞水平[6]。目前Tfh細(xì)胞是否參與了RA關(guān)節(jié)破壞尚未見相關(guān)報(bào)道，同時(shí)Tfh是否參與了RA疾病活動(dòng)也尚無定論[7-9]。本文將研究RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床癥狀的關(guān)系，并將首次根據(jù)關(guān)節(jié)骨侵蝕情況對(duì)RA進(jìn)行分組，以探討CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞在RA發(fā)病及病情進(jìn)展的作用，及其與RA骨破壞的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究收集了2017年1月至2017年5月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診為RA并住院治療的30例患者的病例記錄及相關(guān)臨床資料，年齡22-68歲，其中男性5例，女性25例，病程1個(gè)月-33年。所有患者均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[10]，排除感染、近期有手術(shù)外傷史者及處于妊娠、分娩或哺乳期的女性患者，或同時(shí)患有其他自身免疫性疾病及并發(fā)其他疾病者。同時(shí)選取本院同期體檢中心30名年齡和性別匹配的健康志愿者作為健康對(duì)照組(HC)，年齡22-65歲，平均(49.7±4.98)歲，其中男性5例，女性25例。

1.2方法

1.2.1Tfh細(xì)胞的流式檢測(cè) 用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，將細(xì)胞濃度維持在5×105個(gè)/mL左右,每管約500 μL。向流式管中加入抗體CD4，均為5 μL，CXCR5均為1.5 μL混勻。室溫孵育30 min，洗滌重懸細(xì)胞，使用BDFACSAria流式細(xì)胞儀( BD 公司，美國) 對(duì)處理好的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，每份標(biāo)本至少獲取10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。用Flow Jo 7． 6 軟件(San Diego 公司，美國) 對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢查 所有受試者采集空腹外周血，類風(fēng)濕因子(RF)和C反應(yīng)蛋白(CRP)采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定，紅細(xì)胞沉降率(ESR)采用魏氏法測(cè)定，抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(CCP)采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)測(cè)定，血清免疫球蛋白水平(IgA，IgG，IgM)、血清補(bǔ)體水平(C3,C4)采用速率散射免疫比濁法測(cè)定。

1.2.3臨床數(shù)據(jù)的收集 通過病歷回顧獲得RA患者姓名、性別、年齡、身高、體重、關(guān)節(jié)X線平片、關(guān)節(jié)彩超、腫 脹 關(guān) 節(jié) 數(shù) ( number of swollen joints，SJC) 、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)( number of tender joints，TJC)、患者健康評(píng)估問卷(HAQ)以及用藥情況。根據(jù)上述臨床數(shù)據(jù)，計(jì)算28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)評(píng)分[the disease activity score in 28 joints，ESR-based，DAS28 (ESR)][11]；根據(jù)DAS28(ESR)將RA患者分為2組，即DAS28(ESR)>3.2為高中疾病活動(dòng)度組(19例)，DAS28(ESR)≤3.2為低疾病活動(dòng)或緩解組(11例)。根據(jù)RA患者關(guān)節(jié)X線平片，評(píng)估關(guān)節(jié)破壞情況；分為關(guān)節(jié)骨侵蝕組(15例)與無關(guān)節(jié)骨侵蝕組(15例)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1RA患者和HC組外周血Tfh細(xì)胞水平的比較

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA患者和HC外周血CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平結(jié)果顯示，RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比7.70%(6.10%，9.70%)，明顯高于HC組5.85%(5.07%，7.35%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 RA患者和HC組外周血Tfh細(xì)胞水平的比較

2.2RA疾病活動(dòng)性與Tfh細(xì)胞水平的關(guān)系

按照DAS28評(píng)分將RA患者分為高中疾病活動(dòng)組和低疾病活動(dòng)及緩解組，結(jié)果顯示高中疾病活動(dòng)組CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比(9.64%±3.80%)，明顯高于健康對(duì)照組5.85%(5.07%，7.35%)(P=0.002)；高中疾病活動(dòng)組CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞占CD4+細(xì)胞百分比(9.64%±3.80%)，明顯高于低疾病活動(dòng)及緩解期組(6.85%±2.06%)(P=0.014) ；低疾病活動(dòng)及緩解期組Tfh細(xì)胞水平與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.792)(見圖1)。

2.3RA患者關(guān)節(jié)骨侵蝕與Tfh細(xì)胞水平的關(guān)系

本研究按照是否存在關(guān)節(jié)骨侵蝕對(duì)RA患者進(jìn)行分組研究，結(jié)果顯示有無關(guān)節(jié)骨侵蝕的RA患者組間及與健康對(duì)照組比較，CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見圖2)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，無關(guān)節(jié)骨侵蝕組中，CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平與血沉，HAQ，腫脹關(guān)節(jié)數(shù),晨僵時(shí)間呈明顯正相關(guān)(P<0.05)(見表2)。在關(guān)節(jié)骨侵蝕組中，CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均無明顯相關(guān)性(P>0.05)(見表3)。

表2 無關(guān)節(jié)骨侵蝕RA患者外周血Tfh細(xì)胞水平與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：“*”表示P<0.05

表3 關(guān)節(jié)骨侵蝕RA患者外周血Tfh細(xì)胞水平與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

RA是一種發(fā)病機(jī)制尚不清楚的慢性自身免疫性疾病，普遍認(rèn)為其發(fā)病可能與多種免疫細(xì)胞如抗原特異的T、B 淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞及自身抗體等相互作用有關(guān)[3]。Tfh細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T細(xì)胞亞群，其主要位于次級(jí)淋巴器官的生發(fā)中心中，高表達(dá)標(biāo)志性分子CXCR5，對(duì)抗原特異性B細(xì)胞在GC中的增生和分化起主要的輔助功能[12，13]。研究表明Tfh細(xì)胞參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無力(MG)、骨髓增生異常綜合征(MDS)[13]。近年來的研究報(bào)道[14，15]認(rèn)為Tfh細(xì)胞可能在RA的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮一定作用，例如Tfh細(xì)胞可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞在生發(fā)中心增殖進(jìn)而產(chǎn)生大量的抗CCP抗體等免疫球蛋白。本研究檢測(cè)了RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平，結(jié)果顯示，RA患者Tfh細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組，這一結(jié)果與安樂美[7]等人在RA領(lǐng)域的研究結(jié)果相似。上述結(jié)果表明Tfh細(xì)胞在RA患者中的表達(dá)失調(diào)，提示其可能參與了RA的發(fā)病機(jī)制。但Costantino AB[9]等人的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者與健康對(duì)照組的Tfh細(xì)胞水平不存在差異，可能與患者樣本量少，納入RA患者存在個(gè)體差異等因素有關(guān)。

本研究進(jìn)一步比較疾病活動(dòng)情況不同RA患者與健康對(duì)照組Tfh細(xì)胞水平的差異，發(fā)現(xiàn)高中疾病活動(dòng)組CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平顯著高于低疾病活動(dòng)及緩解組和健康對(duì)照組，而低疾病活動(dòng)及緩解組與健康對(duì)照組無差異。這一結(jié)果與Zhang Y[16]等人在RA領(lǐng)域的研究結(jié)果相似，提示Tfh細(xì)胞主要在疾病高度活動(dòng)時(shí)參與免疫反應(yīng)。這可能與CXCR5/CXCL13信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)[17]。大量的研究表明，白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性因子可調(diào)控血清CXCL13參與炎性反應(yīng)[18,19]。 Nayak LM等人的研究表明，剔除TNF-α基因或其受體TNFRp55基因的小鼠體內(nèi)CXCL13的表達(dá)出現(xiàn)了下降,說明TNF-α與其受體的結(jié)合對(duì)CXCL13的表達(dá)有上調(diào)的作用[17]。此外，張銘明[20]等人的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清 CXCL13水平與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6正相關(guān)。隨著RA病情進(jìn)展、病理改變惡化，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞釋放增多，產(chǎn)生大量炎性因子，致使CXCL13水平升高[21]，因此Tfh細(xì)胞受 CXCL13 趨化而被募集到淋巴濾泡,促進(jìn)Tfh細(xì)胞向B淋巴細(xì)胞和生發(fā)中心遷移，Tfh細(xì)胞可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞在生發(fā)中心增殖進(jìn)而產(chǎn)生大量的抗CCP抗體等免疫球蛋白，促進(jìn)RA的發(fā)生和發(fā)展。安樂美[22]等人的研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清CXCL13水平明顯升高，且增高幅度與疾病活動(dòng)度相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果,RA活動(dòng)期患者體內(nèi)Tfh細(xì)胞水平升高，可能與患者體內(nèi)活躍的免疫狀態(tài)相關(guān)。因此，RA患者外周血Tfh細(xì)胞水平很可能成為評(píng)估RA患者疾病嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)之一。

大量的研究已證明[23]抗CCP抗體水平與RA骨侵蝕程度相關(guān)，因此本研究進(jìn)一步根據(jù)關(guān)節(jié)骨侵蝕情況對(duì)RA患者進(jìn)行分組，探討Tfh細(xì)胞是否參與了RA的關(guān)節(jié)破壞情況。發(fā)現(xiàn)雖然關(guān)節(jié)骨侵蝕組患者Tfh細(xì)胞水平與無關(guān)節(jié)骨侵蝕組無明顯差異，但是在無關(guān)節(jié)骨侵蝕組中，RA患者CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平與血沉、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、HAQ、晨僵時(shí)間等反應(yīng)疾病活動(dòng)性的指標(biāo)正相關(guān)，而在關(guān)節(jié)骨侵蝕組中未發(fā)現(xiàn)此相關(guān)性。這可能與關(guān)節(jié)骨侵蝕發(fā)生過程中炎癥細(xì)胞釋放增多，產(chǎn)生更多的CXCL13相關(guān)[22]。提示CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞可能在RA疾病早期尚未發(fā)生關(guān)節(jié)骨破壞時(shí)發(fā)揮重要作用，促進(jìn)了關(guān)節(jié)骨侵蝕的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RA患者中外周血Tfh細(xì)胞水平顯著升高，且Tfh細(xì)胞主要在疾病高度活動(dòng)時(shí)參與免疫反應(yīng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞可能在RA疾病早期尚未發(fā)生關(guān)節(jié)骨破壞時(shí)發(fā)揮重要作用。這些研究結(jié)果表明Tfh細(xì)胞可能通過多種途徑參與了RA的發(fā)生和發(fā)展,可能在RA疾病早期，即尚未發(fā)生關(guān)節(jié)骨侵蝕階段的病情進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，及時(shí)阻斷該炎癥因子，有可能阻止RA骨破壞的發(fā)生。