孫寬學，夏紅衛(wèi)

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海200135)

近年來，具有高侵襲性及轉移性的肝癌(HCC)已成為全球前三死亡率的惡性腫瘤，平均每年因HCC導致死亡的至少有60萬人左右[1,2]。HCC的形成主要原因為臨床感染乙肝/丙肝病毒。此外，過度飲酒、肥胖、2型糖尿病均與HCC發(fā)病密切相關[3]。目前，HCC非入侵式檢查已成為主要的診斷手段。然而，對肝臟疾病發(fā)展為HCC的預測還無法實現(xiàn)，因此，尋找HCC發(fā)展過程中高相關性的某一指標對患者生存和治療干預具有重要的作用。miRNA是一類具有22個核苷酸的非編碼小RNA，均含有發(fā)卡的二級結構[4,5]。該類小RNA可以直接靶向mRNA對其降解或抑制轉錄，從而達到基因沉默的作用。選擇性表達的miRNA與包括HCC在內的多種類型的腫瘤具有明顯的相關性。血清miRNA已在多種疾病中報道可作為潛在的生物標記物。超過100個外周血miRNA已被驗證用于不同腫瘤疾病的診斷，且該數(shù)字在不斷攀升[6]。報道指出，miR-30e 可作為乳腺癌亞型特異的預后標志物之一[7,8]，且在慢性髓性白血病患者中表達較正常人群低[9]。另一方面，miR-223可作為肺癌的生物標志物進行疾病的診斷[10]。然而，目前還沒有相關報道指出miR-30e和miR-223在HCC患者中的相關檢測和作用機制。本次研究將探究不同發(fā)病類型的HCC患者血清中miR-30e和miR-223的表達情況，以期對該類型疾病患者非侵入生物標志物的研究提供一定的指導價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月-2016年8月在我院腫瘤科就診的HCC患者45例為觀察組，其中男性32例，女性13例，年齡范圍為39-88歲，平均年齡60.4±22.6歲?？紤]到HCC患者感染類型不同，本次研究納入3種HCC感染類型，包括16例HCV感染(HCV-HCC)、16例HBV感染(HBV-HCC)、13例非病毒感染(NV-HCC)患者。同時選取19例慢性肝病(CLD)和16例具有正常的氨基轉移酶活性，無嗜酒，且經(jīng)診斷無肝臟疾病及HBV、HCV感染陰性的健康人為對照組(HV)，其中男性11例，女性5例，年齡范圍為38-69歲(平均年齡59.3±19.7歲)。各組年齡、性別、ALT和AST對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 各組基本臨床資料對比

1.2方法采集所有HCC患者和健康人的靜脈血各5 mL，取上清后放于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r收集HCC患者癌組織和癌旁組織。血清RNA通過QIAGEN miRNAeasy Mini kit試劑盒進行抽提。采用ABI公司生產(chǎn)的TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒將提取的血清樣本RNA逆轉錄為cDNA。合成相應microRNA的Taqman熒光探針，采用ABI公司的Step One熒光定量PCR儀對miR-30e和miR-223進行RT-qPCR。所有入組標本均重復3個復孔。本次研究的內參為U6。miRNA的相對表達水平為2-ΔΔCT。

2 結果

2.1健康人群、慢性肝病和肝癌患者血清miR-30e和miR-223的表達水平比較首先對miR-30e和miR-223的引物擴增和溶解曲線進行分析，確定其可用于本次實驗(圖1)。通過分析QRT-PCR檢測得出miR-30e和miR-223在HV組、CLD組和HCC患者的CT值發(fā)現(xiàn)，HCC患者miR-30e和miR-223血清表達水平明顯低于HV組和CLD組，組內對比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HV組和CLD組相比則無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

圖1 U6、miR-30e和miR-223的擴增和溶解曲線

圖2 HV、CLD和HCC患者血清miR-30e和miR-223的表達水平

2.2健康人群、慢性肝病和肝癌患者血清miR-30e和miR-223的ROC曲線比較miR-30e表達情況在HV和HCC(圖3A)以及CLD和HCC(圖3C)的ROC分析得出其AUC值分別為0.9258±0.032和0.9322±0.031，敏感性分別為89.06%和86.67%，特異性分別為81.25%和100%，cutoff值分別為0.7685和0.4755；血清miR-223表達水平在HV和HCC(圖3B)以及CLD和HCC(圖3D)的AUC值分別為1.000±0和0.9988±0.002，敏感性分別為100%和97.78%，特異性分別為100%和100%，cutoff值分別為和0.5095和0.4310。

2.3健康人群、慢性肝病和不同類型肝癌患者血清miR-30e和miR-223表達情況隨后進一步分析發(fā)現(xiàn)，無論是HV組，還是CLD組，血清miR-30e和miR-223表達水平均顯著高于HBV-HCC、HCV-HCC和NV-HCC組(圖4)，表明不同類型的HCC患者其miR-30e和miR-223表達水平均表現(xiàn)出一致的下調趨勢。

2.4HCV-HCC患者肝癌組織和癌旁組織miR-30e和miR-223的表達水平比較如圖5A和B顯示，HCV-HCC患者miR-30e和miR-223在肝癌組織中均出現(xiàn)明顯的下調，且下調幅度與血清中HCC患者與正常人群中的比較相似。

圖3 HV、CLD和HCC患者血清miR-30e和miR-223的ROC曲線

3 討論

報道顯示，HCC作為常見的惡性腫瘤之一，已成為全球高死亡率的疾病之一。研究指出，血清miRNA異常表達對癌癥的發(fā)病和疾病進展起到重要的作用，因此許多研究學者認為，血清miRNA可作為腫瘤疾病的潛在非侵入性生物標志物，對臨床診斷及預后診斷起到一定的幫助[11-13]。例如，miR-25、miR-184、miR-92a和miR-122分別為肺癌、鱗狀細胞癌、白血病和肝損傷的篩選標志物[10,14-16]。

miR-30e在乳腺癌診斷、慢性髓性白血病發(fā)病進展和肝纖維化保護方面起到一定的作用[7-9,17]。通過預測miR-30e的靶基因發(fā)現(xiàn)，miR-30e能夠靶向自噬相關基因(如ATG5)。自噬通路在肝臟組織的正常發(fā)育過程中起到非常重要的作用，可作為肝臟疾病的治療靶點[18]。因此，miR-30e在HCC患者中處于抑制的狀態(tài)，異常激活自噬，從而影響肝組織正常的自噬流運轉。miR-223在調控細胞色素、胰島素樣生長因子1受體、微管動力中發(fā)揮關鍵作用，間接表明其在腫瘤增殖過程中起到重要調控作用[19-21]。有報道指出，miR-223在HCC中過表達增加抗癌藥物在HCC細胞系中的敏感性[22]。本研究通過對在不同感染類型HCC患者血清miR-30e和miR-223的表達及ROC曲線分析，表明HCC患者miR-30e和miR-223表達水平下調，且具有較高的敏感性和特異性，顯示血清miR-30e和miR-223可作為HCC疾病診斷的潛在生物標志物之一，同時進一步說明HCC患者細胞增殖調控紊亂。另外，在本次收集不同感染類型的HCC患者中，HBV、HCV和NV組患者的miR-30e和miR-223均出現(xiàn)顯著的下調，且下調幅度相似，表明血清miR-30e和miR-223不受HCC感染類型的限制，提示其可作為一種HCC診斷的廣譜型生物標志物，具有重要的臨床診斷意義。值得注意的是，本次研究還對HCV患者癌變組織進行miR-30e和miR-223檢查，結果與血清結果相似，同時結合HCC患者中較CLD與HV顯著降低的結果，提示miR-30e和miR-223在HCC患者臨床病理診斷、病情評估、早期診斷上有廣闊的應用前景。

圖4HV、CLD和不同類型HCC患者血清miR-30e和miR-223表達水平圖5HCV-HCC患者肝癌組織和癌旁組織miR-30e和miR-223的表達水平

通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-30e和miR-223的表達水平出現(xiàn)下調與HCC相關，且具有高靈敏性和特異性。同時注意到，不管是血清還是活檢病理組織，均出現(xiàn)下調的一致性，表明miR-30e和miR-223可作為HCC無創(chuàng)生物標志物的潛力。后續(xù)可通過較大的隊列研究進一步探究其診斷價值。