張?jiān)讫?，宋曉飛，段云靜，趙輝明，趙瑞力

(1.石家莊市第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科三病區(qū)，河北 石家莊050011；2.河北省人民醫(yī)院 耳鼻喉科；3.石家莊市第一醫(yī)院 耳鼻喉科；4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 耳鼻喉科)

喉癌是耳鼻咽喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤，其中以鱗狀細(xì)胞癌最為多見。有關(guān)喉癌發(fā)生機(jī)制至今尚不清楚。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)展，癌基因激活和抗癌基因失活在致喉癌病因研究中備受關(guān)注。Fra-2屬原癌基因，一定條件下，可被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，發(fā)揮致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的功能。先前研究顯示，永生化的惡性角質(zhì)上皮細(xì)胞高表達(dá)磷酸化的Fra-2[1]。近年研究顯示，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多系統(tǒng)腫瘤中均可檢測(cè)到Fra-2基因的高表達(dá)[2]，而這種基因在喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)中的研究尚未見報(bào)道。本研究通過免疫組化及RT-PCR法對(duì)Fra-2基因在喉鱗狀細(xì)胞癌以及癌旁正常組織當(dāng)中的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究它在癌組織當(dāng)中表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

本院2012至2015年間行喉癌切除術(shù)患者的標(biāo)本，取喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本47例，對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織21例。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)分組(表1)：病理分級(jí)組中，高分化包括G1和G2，低分化為G3；臨床分期組主要基于(UICC)TNM分類標(biāo)準(zhǔn)；在淋巴結(jié)分組當(dāng)中，N+代表出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，N0代表未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；吸煙組當(dāng)中，煙齡(年)與每日吸煙量(支)乘積大于等于四百為陽性，小于四百為陰性；解剖分區(qū)組則根據(jù)腫瘤的生長范圍分成聲門上區(qū)及聲門區(qū)。

1.2方法

免疫組化SP法按試劑盒說明操作。Fra-2 鼠抗人單克隆抗體Sc-166102購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司。二抗免疫組化試劑盒型號(hào)(SP-9002)以及DAB液ZLI-9032購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RT-PCR方法：嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，將組織提取并檢測(cè)RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，后行擴(kuò)增，將最終產(chǎn)物放入凝膠行電泳完畢后攝像觀察。RNA提取所用TRIzol 購自美國SBS公司，RT-PCR 試劑盒購自美國Promega公司，DNA Maker 購自北京索來寶科技有限公司，PCR 引物購自上海生工生物工程有限公司， Fra-2上游引物(5’→3’)GAAGAGGAGGAGAAGCGTCG,下游引物(5’→3’)CTCGGGGCTAATCTTGCACA。GAPDH為內(nèi)參照，上游引物(5’→3’)AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物(5’→3’)AGGGGTCATTGATGGCAACA。

1.3結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果評(píng)分方法[3]：將染色強(qiáng)度 (intensity，I)及陽性細(xì)胞百分率(percentage，P) 均分級(jí)評(píng)分。最終組織學(xué)評(píng)分(histologiescore，H)=I×P。結(jié)果： 0-3分為低表達(dá)，4-6分為中度表達(dá)，7-9分為高表達(dá)。其中，低表達(dá)計(jì)為陰性，中表達(dá)以及高表達(dá)計(jì)為陽性。RT-PCR主要使用的軟件為Gel work-2ID行結(jié)果分析，其中使用的參數(shù)為目的基因電泳圖像當(dāng)中條帶光密度值分別除以GAPDH所對(duì)應(yīng)的光密度值，所得數(shù)值代表的是基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1免疫組化結(jié)果

Fra-2蛋白陽性染色呈棕色，片狀或彌漫性分布于細(xì)胞核、細(xì)胞漿(圖1)。癌組織中表達(dá)陽性率70.2%(33/47)，癌旁組織中為 33.3%(7/21)。兩者之間存在的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(χ2=8.150，P<0.05)(表2)。取喉鱗癌組織分析Fra-2基因蛋白表達(dá)和多個(gè)臨床病理參數(shù)中組差異具體參見表1， Fra-2基因蛋白表達(dá)在臨床分期組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析存在差異顯著(P<0.05)，吸煙組對(duì)比分析差異非常顯著(P<0.01)；然而卻在病理分級(jí)、患者年齡、解剖分區(qū)組內(nèi)對(duì)比無差異(P>0.05)。

A為癌旁正常組織(×400)，B為喉鱗癌組織(×400)圖1 免疫組化Fra-2基因在癌旁正常組織及喉鱗癌組織中表達(dá)表1 喉鱗癌組織中Fra-2蛋白和mRNA在各臨床病理參數(shù)組中表達(dá)

臨床參數(shù)nFra-2蛋白例(%)PmRNA(x—±s)P病理分級(jí) G1+G23725(67.6)0.7000.33±0.330.001 G3108(80.0)0.75±0.41臨床分期 Ⅰ+Ⅱ189(50.0)0.0170.35±0.390.368 Ⅲ+Ⅳ2924(82.8)0.46±0.38淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N+2622(84.6)0.0160.51±0.430.450 N02111(52.4)0.30±0.30吸煙 陽性3832(84.2)0.0000.45±0.410.246 陰性91(11.1)0.28±0.23年齡/歲 <60159(60.0)0.3240.31±0.330.214 ≥603224(75.0)0.47±0.41解剖分區(qū) 聲門上區(qū)2117(81.0)0.1480.40±0.410.792 聲門區(qū)2616(61.5)0.43±0.38

表2 喉鱗癌及癌旁正常組織中Fra-2蛋白和mRNA的表達(dá)

2.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fra-2 mRNA 在喉鱗狀細(xì)胞癌以及癌旁組織當(dāng)中的表達(dá)具體參見圖2，表達(dá)量分別為(0.42±0.39)、(0.07±0.06)，兩者對(duì)比分析差異非常顯著(P<0.01)(表2)。癌組織中，F(xiàn)ra-2基因mRNA 表達(dá)在多個(gè)臨床病理參數(shù)組別中的對(duì)比分析結(jié)果見表1。表中呈現(xiàn)的Fra-2基因mRNA表達(dá)僅在病理分級(jí)組中差異非常顯著(P<0.01)，而其他組中(臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者年齡、吸煙習(xí)慣、解剖分區(qū))差異無意義(P>0.05)。

圖2喉鱗癌及癌旁組織中Fra-2mRNA水平表達(dá)電泳圖像，其中單數(shù)(1、3、5、7)為喉鱗癌電泳圖，雙數(shù)(2、4、6、8)為癌旁正常組織電泳圖

3 討論

Fra-2基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子AP-1(activator protein 1)家族中Fos 亞家族中的成員[2]?？杉せ頔GF-R、PI3K和MAPK等信號(hào)通路并通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡抑制[4]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fra-2的蛋白和mRNA水平在喉鱗癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有非常顯著意義。提示Fra-2均參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Risto[4]等在對(duì)前列腺癌PC-3和DU-145兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、輻射、增殖等試驗(yàn)研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)Fra-2通過非獨(dú)立因素激活PI3K通路促進(jìn)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。另有研究示，AP1家族中的Fra-2基因，可促進(jìn)MAPK磷酸化從而活化此通路，繼而發(fā)揮激活目標(biāo)基因啟動(dòng)子增加細(xì)胞轉(zhuǎn)錄功能[5]。這些實(shí)驗(yàn)表明Fra-2具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化潛力。

關(guān)于Fra-2基因在LSCC組織蛋白水平中的表達(dá)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面(相比于N0組來說，N+組顯著更高)，臨床分期方面(相比Ⅰ、Ⅱ期患者來說，Ⅲ、Ⅳ期患者顯著更高)，吸煙習(xí)慣方面(相比于陰性組患者來說，陽性組患者顯著更高)，差異均存在顯著或非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在 mRNA水平方面只有病理分級(jí)(低分化組高于高、中分化組)，差異對(duì)比分析有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床參數(shù)中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙、年齡，組內(nèi)對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wang JunFeng等[6]選取人肺癌A549細(xì)胞系，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、免疫組化、Western blotting、qRT-PCR等技術(shù)行實(shí)驗(yàn)分析，證明Fra-2通過與Smad3相互作用促進(jìn)TGF-b1誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Tomonori Higuchi等[7]運(yùn)用基因敲除技術(shù)證實(shí)，F(xiàn)ra-2/Jund異源二聚體可結(jié)合SOX4的AP-1位點(diǎn)，促進(jìn)基因表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)成人T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)展。以上結(jié)論與我們研究結(jié)論(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白水平相比于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組來說顯著更高，臨床分期中處于Ⅲ、Ⅳ期的患者，其蛋白水平相比于Ⅰ、Ⅱ期的患者來說顯著更高)相同。有關(guān)Fra-2基因吸煙陽性組表達(dá)相比于吸煙陰性組來說顯著更高，Erin Gensch等[8]研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧可使EGFR-JNK/ERK通路磷酸化，進(jìn)而活化JunD/Fra-2異源二聚體，促進(jìn)下游MUC5AC表達(dá)增多。而Zhang ziqiang[9]等通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系，行Real-time quantitative PCR及Western blot分析，結(jié)果MUC5A表達(dá)增多者，肺腺癌轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。綜合研究結(jié)果表明吸煙煙霧可通過激活Fra-2的上下游通路促進(jìn)惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Shilpi Gupta等[10]通過對(duì)舌癌組織、癌前病變組織、正常舌組織、舌癌細(xì)胞株分別進(jìn)行RT-PCR 及Western blotting實(shí)驗(yàn)分析，與舌癌前病變及正常舌組織相比，舌癌組織及舌癌細(xì)胞株有較高的c-fos/Fra-2轉(zhuǎn)錄水平，并證明此異源二聚體過多表達(dá)可促進(jìn)舌組織細(xì)胞異型性增加。此結(jié)論與我們研究的(mRNA水平僅病理分級(jí)低分化組高于高、中分化組)吻合。以上文獻(xiàn)報(bào)道顯示，F(xiàn)ra-2基因可通過間接或與其他因子結(jié)合形成異源二聚體共同作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生、惡化及轉(zhuǎn)移能力。

Fra-2作為原癌基因，在惡性腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)研究，喉鱗癌組織中Fra-2 基因的表達(dá)顯著增高，并通過對(duì)比多種臨床參數(shù)分析此基因活化表達(dá)增多可通過多種途徑參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展，檢測(cè)喉癌組織中Fra-2的表達(dá)水平對(duì)喉癌的早期診斷及為分子生物學(xué)靶向治療提供重要參考價(jià)值。