趙瑞 姚黎清

[摘要] 目的 觀察人類ApoE3基因過表達對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12凋亡的影響。 方法 將PC12轉染含人ApoE3基因的pEGFP質粒及空載體pEGFP質粒，經持續(xù)篩選建立起穩(wěn)定表達人ApoE3基因和質粒pEGFP的PC12的細胞系。將細胞分成4組：正常對照組（用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、H2O2組（用400 μmol/L H2O2誘導4 h）、H2O2+空質粒組（細胞轉染pEGFP經篩選后用H2O2誘導4 h）、H2O2+ApoE3組（細胞轉染ApoE3經篩選后用H2O2誘導4 h）。通過CCK-8檢測細胞存活率，Hochest33258檢測細胞凋亡。 結果 與正常對照組比較，H2O2組、H2O2+空質粒組和H2O2+ApoE3組細胞存活率下降（P < 0.05），細胞凋亡增加。H2O2組和H2O2+空質粒組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；H2O2+ApoE3組細胞存活率明顯高于H2O2組、H2O2+空質粒組（P < 0.05），H2O2組+ApoE3組細胞凋亡較H2O2組和H2O2+空質粒組明顯減少。 結論 ApoE3基因高表達對H2O2所致的PC12細胞氧化損傷有很好的保護作用。

[關鍵詞] PC12細胞；載脂蛋白E3基因；過氧化氫；凋亡

[中圖分類號] R744 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0004-04

[Abstract] Objective To observe the effect of human ApoE3 gene high expression on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells. Methods The pEGFP plasmid containing human ApoE3 gene and pEGFP plasmid were transfected with PC12 cells， and PC12 cell line was established that could stably express human ApoE3 gene and pEGFP plasmid through continuous screening. PC12 cells were allocated into 4 groups： normal control group， H2O2 group （cultured with 400 μmol/L H2O2 for 4 hours）， liposome group （pEGFP transfection and H2O2 culture） and ApoE3 group （ApoE3 transfection and H2O2 culture）. Cell survival was tested by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by Hochest33258. Results Compared with the normal control group， cell survival rate was decreased in the other three groups （P < 0.05）， while cell apoptotic was increased. The differences in the indexes mentioned above were not significant between H2O2 group and liposome group（P > 0.05）. The cell survival rate was higher in the ApoE3 group， compared with H2O2 group and H2O2+liposome group （P < 0.05）； the apoptosis was obviously lower in the ApoE3 group， compared with the H2O2 group and H2O2+liposome group. Conclusion The overexpression of ApoE3 gene has a great protective effect on the oxidative damage of PC12 cell mediated by H2O2.

[Key words] PC12 cells； Apolipoprotein E3 gene； Hydrogen Peroxide； Apoptosis

脊髓損傷是一類致殘率和致死率均較高的中樞神經系統(tǒng)疾病，由于此類疾病治療困難，術后康復時間長，多預后不良，給患者家庭以及社會造成沉重的經濟負擔。急性期脊髓二次損傷的發(fā)生與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量聚集密切相關，氧化應激成為脊髓損傷的一個特點，大量ROS通過氧化細胞的DNA、蛋白質和細胞膜損害細胞。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）作為中樞神經系統(tǒng)中最主要的載脂蛋白，參與了神經元脂質的代謝、鈣的轉運、信號的轉導等，與腦外傷、腦出血性疾病和脊髓損傷患者的預后都有密切的關系。人類ApoE存在ApoE2、ApoE3、ApoE4三種亞型，在疾病的發(fā)生和預后等方面，不同亞型的攜帶者表現(xiàn)出不同的效應，其中ApoE2、ApoE3能促進脊髓損傷患者功能恢復，ApoE4對脊髓損傷患者功能恢復有不良影響[1]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ApoE參與了脊髓損傷后氧化應激的過程[2]。本實驗擬用H2O2刺激PC12細胞建立氧化損傷模型，用以研究脊髓損傷后神經細胞病理學變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及來源

PC12細胞購自中科院昆明動物所；脂質體2000（Lipofectamine 2000）購自Invitrogen公司產品；遺傳霉素（G418）為Sigma產品；過氧化氫（H2O2）為天津市風船化學試劑科技有限公司產品；高糖培養(yǎng)基（DMEM）為Hyclone公司產品；胰蛋白酶購自GIBICO公司；胎牛血清為BI公司產品；DMSO購于上海生物工程有限公司；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒試劑為日本同仁公司產品；Hochest33258試劑為凱基公司產品；攜帶人ApoE3基因的質粒（pEGFP-N1-H-ApoE3）上海吉滿公司構建。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng)

PC12細胞按常規(guī)細胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。消化傳代使用含有EDTA的0.25%胰酶，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 基因轉染及細胞篩選

1.2.2.1 細胞轉染 取對數(shù)生長期的PC12細胞經胰酶消化后，以1×105/mL密度接種于6孔板中，待細胞生長至80%融合時，取2 μg質粒加入到200 μL基礎培養(yǎng)基中輕輕搖勻后在室溫下放置5 min；取10 μL脂質體加入到200 μL基礎培養(yǎng)基中輕輕搖勻后再在室溫下放置5 min；然后混合稀釋的脂質體和質粒輕輕搖勻，室溫孵育30 min，最后將混合液輕輕加入到待轉染的細胞中，4～6 h后換液。

1.2.2.2 細胞篩選 ①最佳G418篩選濃度確定：設置不同的G418梯度濃度連續(xù)培養(yǎng)細胞2周，以細胞完全死亡的最低G418濃度為篩選濃度，根據預實驗確定最佳G418篩選濃度為1000 μg/mL；②將轉染后24 h的細胞用1000 μg/mL G418連續(xù)篩選培養(yǎng)2周，每2天換液1次，直到單性克隆細胞株出現(xiàn)；挑選單克隆細胞株擴增培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組

①正常對照組（正常細胞培養(yǎng)）；②H2O2組；③H2O2+空質粒組（轉染pEGFP-N1+H2O2）；④H2O2+ApoE3組（轉染pEGFP-N1-H-ApoE3+H2O2）。

1.2.4 H2O2誘導PC12細胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的細胞，細胞計數(shù)密度為4×104個/mL鋪于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，分別采用0、200、400、600、800 μmol/L的 H2O2進行干預，每孔設5個復孔，損傷4 h后用CCK-8檢測細胞活性以確定最佳損傷濃度。

1.2.5 ApoE3對PC12細胞的保護作用檢測

正常對照組加入100 μL基礎培養(yǎng)基；模型組400 μmol/L H2O2作用4 h；空質粒組400 μmol/L H2O2作用4 h；ApoE3組400 μmol/L H2O2作用4 h，4 h后加入CCK-8避光孵育1～4 h后酶標儀檢測OD值；按照公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組-空白對照組）/（正常對照組-空白對照組）×100%。

1.2.6 細胞凋亡檢測

細胞轉染率計算（Hochest33258 染色法）：正常Hochest33258熒光染色顯示PC12細胞核圓呈淡藍色熒光，凋亡細胞的胞核呈強亮白色熒光。實驗時先使用PBS清洗3遍，用4%的多聚甲醛室溫固定細胞30 min，PBS清洗3遍然后每孔加入300 μL Hoechst33258染色液，室溫下避光染色5 min，PBS清洗3次，在正置熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析采用Pearson相關，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ApoE3蛋白在PC12細胞中的表達

光學顯微鏡觀察所示，ApoE3組細胞形態(tài)沒有發(fā)生改變，細胞呈錐形，遮光性好；熒光顯微鏡下觀察可見ApoE3組細胞內表達帶有綠色熒光的ApoE3蛋白。光學顯微鏡下所示，空質粒組細胞生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)正常；熒光顯微鏡下觀察可見細胞質中表達出均勻的綠色熒光蛋白。見圖1（封四）。

2.2 H2O2誘導PC12最佳損傷濃度確定

與0 μmol/L H2O2組比較，200、400、600、800 μmol/L H2O2組細胞存活率降低，且與H2O2濃度呈線性負相關（r = -0.981，P < 0.05），其中400 μmol/L H2O2組細胞存活率為（48.66±0.07）%，在后續(xù)試驗中采用此濃度建立PC12細胞損傷模型。見表1。

2.3 ApoE3對神經細胞的保護作用

與正常對照組比較，H2O2組、H2O2+空質粒組、H2O2+ApoE3組細胞存活率降低（P < 0.05）。H2O2+空質粒組與H2O2組細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與H2O2組、H2O2+空質粒組比較，H2O2+ApoE3組細胞存活率顯著升高（P < 0.05）。見表2。

2.4 細胞凋亡檢測結果

Hochest33258熒光染色顯示：正常PC12細胞核圓呈淡藍色，細胞核完整，凋亡細胞的胞核呈強亮白色熒光，細胞核固縮，甚至破碎；其中正常對照組細胞凋亡很少，其他組細胞凋亡明顯，但H2O2+ApoE3組凋亡細胞較H2O2組和H2O2+空質粒組明顯減少。見圖2（封四）。

3 討論

脊髓損傷的機制主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。其中，原發(fā)性損傷是局限的、不可逆的，損傷后數(shù)分鐘到數(shù)天內可逐漸形成可干預的繼發(fā)損害。繼發(fā)性脊髓損傷的病理改變是由微循環(huán)障礙、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、一氧化氮機制、細胞調亡與壞死、鈣超載、炎性反應、神經肽、內皮素、前列腺素等共同作用的結果。脊髓組織含有豐富的脂類物質，易感于脂質過氧化反應，生理狀態(tài)下，內源性氧化系統(tǒng)（包括超氧化物歧化酶和過氧化氨酶等）為了維持人體內各種細胞和亞細胞的結構完整性，會有效地消除人體內多余的自由基。脊髓損傷后，自由基生成增加、清除障礙，脊髓組織脂質過氧化產物蓄積，細胞膜的結構、流動性和通透性遭到破壞，同時抗氧化劑水平降低、Na+-K+-ATP酶系統(tǒng)受抑制，脊髓組織缺血、缺氧，細胞能量代謝失常，細胞內鈣超載使細胞線粒體電子傳遞鏈脫偶聯(lián)，進而又產生和釋放大量氧自由基，最終導致神經細胞及髓鞘的結構與功能受到損害[3-4]。有研究認為ROS可誘導脂質過氧化作用，并在脊髓損傷過程中發(fā)揮中樞性作用。ROS生成增多或未及時清理，會引起細胞凋亡、壞死或自噬，進而導致神經元功能喪失[5-6]。ApoE分子量為34 kD，由299個氨基酸組成，基因位于19號染色體上[7]，在血漿膽固醇和甘油三酯代謝中發(fā)揮重要的作用。研究人員通過離子層析和雙向電泳已成功鑒定出這3種不同的亞型，主要區(qū)別在于112位的半胱氨酸和158位的精氨酸有所差異，其中人體內ApoE3的基因頻率最高[8]。近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)ApoE在脊髓損傷后表達量增高[9]，國外有學者利用外源性ApoE模擬肽治療小鼠脊髓損傷效果明顯[10]，這些研究印證了ApoE具有神經保護作用。ApoE4基因作為阿爾茨海默病的危險因素早已被人們所熟知[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)ApoE2、ApoE3能夠促進神經元突起生長，使神經元突起數(shù)量增加更快，而ApoE4的作用明顯弱于ApoE2和ApoE3[14]。這種作用是因為ApoE與線粒體膜上F1-ATPase亞基結合破壞了線粒體結構[15]，而神經元的線粒體主要參與了突觸的發(fā)生功能。

氧化應激在繼發(fā)性脊髓損傷中發(fā)揮主導作用，越來越多的研究表明ApoE與氧化應激有關。有文獻報道ApoE4可以和神經元中的線粒體結合，這就為人們研究ApoE與氧化應激的相關性提供了一個重要的靶點，它提示ApoE可能通過作用于線粒體來影響氧化應激[15]。研究表明內源性ApoE會降低中樞神經系統(tǒng)炎性反應及氧化應激反應程度從而發(fā)揮神經保護作用[16]。氧化應激不僅會造成細胞的損傷而且可以通過激活細胞內的信號通路引起細胞凋亡，也有學者發(fā)現(xiàn)ApoE可以降低細胞色素C的釋放，抑制Caspase-3凋亡途徑，從而發(fā)揮保護中樞神經的作用[17]，但是對于ApoE亞型的作用研究不夠明確。因為相較ApoE2和ApoE4而言，ApoE3是人體內存在最多的載脂蛋白，它的作用機制對于研究ApoE對神經細胞保護作用有重要意義。

本實驗通過構建人類ApoE3過表達載體，并在H2O2作用下觀察其對神經細胞的保護作用。初步發(fā)現(xiàn)ApoE3能夠提高神經細胞存活率，減少細胞凋亡。遺憾的是，關于ApoE3對神經細胞保護作用的機理目前還缺乏系統(tǒng)的研究，ApoE3是通過影響線粒體、ERK通路還是其他作用機制發(fā)揮神經保護作用有待進一步的研究。

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