田 笑，金梅花，劉莉園，何 鑫，全吉淑*

大豆異黃酮是大豆中分離的重要活性成分，具有典型異黃酮結(jié)構(gòu)。自從Walz[1]首次從大豆分離出染料木苷以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)12 種不同結(jié)構(gòu)的大豆異黃酮，分別為游離型大豆異黃酮3 種（7,4’-二羥異黃酮——大豆苷元、7,4’-二羥-6-甲氧異黃酮——大豆黃素、5,7,4’-三羥異黃酮——染料木素）和對應(yīng)的葡萄糖苷及其衍生物9 種[2]。研究表明，大豆異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管等多種藥理活性[2-6]。流行病學調(diào)查顯示，大豆異黃酮的攝取與乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌及前列腺癌等多種癌癥的發(fā)病率呈負相關(guān)性[7-10]。動物及細胞實驗也顯示，大豆異黃酮具有明顯的抗腫瘤作用，特別是對激素相關(guān)性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌[11-13]。其抗癌機制可能包括類雌激素作用及抗激素作用、抑制腫瘤血管生成的作用、阻滯細胞周期等多個方面[14-16]。盡管流行病學和動物、細胞模型的研究結(jié)果明確了其抗腫瘤作用，但其對腫瘤細胞凋亡的作用機理和靶點尚不清楚。本課題組近年來的研究表明，大豆異黃酮對家兔鱗癌移植瘤和小鼠肝癌移植瘤均具有促細胞凋亡作用[5-6]。眾所周知，細胞凋亡存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，有許多蛋白參與其調(diào)控過程，如死亡受體、胞漿信號轉(zhuǎn)導蛋白、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）家族和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）家族等[7]。本實驗擬通過小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型，探討大豆異黃酮對H22移植瘤細胞的促凋亡作用機制，旨在為大豆異黃酮抑制腫瘤研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由延邊大學實驗動物中心提供。

小鼠H22肝癌細胞株由延邊大學醫(yī)學院韓春姬教授惠贈。

大豆異黃酮（純度≥80%）購自華北制藥集團有限責任公司，含大豆苷45.9%（質(zhì)量分數(shù)，下同）、黃豆苷21.0%、染料木苷13.4%、大豆苷元0.96%、黃豆苷元0.05%和染料木素0.02%。

5-氟尿嘧啶（5-fuorouracil，5-Fu） 上海旭東海普藥業(yè)有限公司；細胞凋亡-DNA ladder抽提試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；小鼠Caspase-3（Casp-3）單克隆抗體、兔Caspase-8（Casp-8）單克隆抗體、小鼠Caspase-9（Casp-9）單克隆抗體、兔Bcl-2多克隆抗體、兔細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）單克隆抗體、兔細胞凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）單克隆抗體、小鼠p53單克隆抗體、兔Survivin單克隆抗體、兔信號傳導子及轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3單克隆抗體、兔p-STAT3單克隆抗體 美國賽信通公司；小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）多克隆抗體 美國艾博抗公司；小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠免疫球蛋白G、羊抗兔免疫球蛋白G美國西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機 德國艾本德公司；平板電泳槽北京六一生物科技有限公司；小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽 美國伯樂公司；化學發(fā)光成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建立H22小鼠肝癌移植瘤模型及分組處理

常規(guī)進行細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和腹腔傳代。取第2代腹水，將細胞密度調(diào)至1×107個/mL，接種到小鼠腋下[5]。第2天，將30 只小鼠分為模型組（陰性對照組）、大豆異黃酮組和5-Fu組（陽性對照組）。大豆異黃酮組小鼠每日灌胃100 mg/kg大豆異黃酮（含質(zhì)量分數(shù)0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水溶解），共10 次；5-Fu組小鼠隔日腹腔注射25 mg/kg 5-Fu，共5 次；模型組小鼠灌胃等體積含0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水。16 h后處死動物，迅速取出腫瘤組織，稱瘤質(zhì)量，并根據(jù)下式計算抑瘤率。

1.3.2 DNA ladder法檢測腫瘤細胞凋亡

提取移植瘤細胞DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測腫瘤細胞凋亡特征性DNA ladder[6]。

1.3.3 蛋白印跡法檢測移植瘤組織蛋白的表達

裂解細胞并提取蛋白，加熱變性。進行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，用相應(yīng)一抗孵育，洗膜，二抗孵育。化學發(fā)光顯色法顯色，并進行灰度分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以 ±s表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

模型組、大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠瘤質(zhì)量分別為2.00、1.30、0.83 g；抑瘤率計算結(jié)果顯示，大豆異黃酮和5-Fu對荷瘤小鼠的抑瘤率分別為36%和59%。與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠瘤質(zhì)量減輕（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組瘤質(zhì)量增加（P＜0.05）。提示大豆異黃酮和5-Fu明顯抑制荷瘤小鼠肝癌移植瘤的生長，但大豆異黃酮的抑瘤作用低于5-Fu。

2.2 移植瘤組織DNA ladder檢測

圖1 移植瘤組織DNA ladder檢測結(jié)果Fig. 1 DNA ladder observation of transplanted tumor tissue

細胞凋亡時DNA在核小體間斷裂形成一些DNA ladder，其形成是判斷細胞凋亡的重要標準[6]。如圖1所示，模型組小鼠移植瘤細胞有少量凋亡特征性DNA ladder存在。與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤細胞凋亡特征性DNA ladder增多（P＜0.05）。5-Fu組小鼠移植瘤細胞DNA損傷較為嚴重，DNA ladder少量存在，更多的是細胞壞死引起的DNA無規(guī)則斷裂。

2.3 移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段的表達

Caspase是一組胞漿蛋白水解酶，與真核細胞凋亡密切相關(guān)，在正常細胞內(nèi)以無活性的酶原狀態(tài)存在，可將部分肽段切除后激活成有活性的片段，其中Casp-3為凋亡執(zhí)行者，可直接水解靶蛋白從而導致細胞凋亡[17-18]。

圖2 移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段表達Fig. 2 Expression of active caspase-3, caspase-8 and caspase-9 fragments in transplanted tumor tissue

由圖2可知，與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段增多（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-8和Casp-9活性片段增多（P＜0.05）。

2.4 移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達

圖3 移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達Fig. 3 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in transplanted tumor tissue

許多蛋白參與細胞凋亡的調(diào)控過程，其中Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡研究中最受重視的癌蛋白之一，其中，Bax促進細胞凋亡，而Bcl-2抑制細胞凋亡[19-21]。由圖3可知，與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤細胞Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），5-Fu組小鼠移植瘤細胞Bcl-2蛋白表達有降低趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤細胞Bax蛋白表達均升高（P＜0.05），且兩組小鼠移植瘤組織Bax/Bcl-2比值均顯著升高（P＜0.05）。

2.5 移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達

細胞凋亡時，線粒體內(nèi)Cyt c可釋放到胞漿后導致依賴Caspase的凋亡途徑，AIF則為不依賴Caspase的凋亡效應(yīng)分子；而Bcl-2能夠阻止Cyt c和AIF從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生[19-21]。

圖4 移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達Fig. 4 Expression of cytoplasmic Cyt c and AIF proteins in transplanted tumor tissue

由圖4可知，與模型組比較，大豆異黃酮組和5-Fu組小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達均升高（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

2.6 移植瘤組織p53、Survivin蛋白表達和STAT3活化

Bcl-2家族也受多種信號途徑的調(diào)控，其中p53和Survivin是研究廣泛的途徑之一，STAT3也是近年來研究較多的一條胞內(nèi)信號通路[22-23]。

圖5 移植瘤組織p53、Survivin蛋白表達和STAT3活化Fig. 5 Expression of p53 and survivin proteins, and STAT3 activation in transplanted tumor tissue

由圖5可知，與模型組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織p53蛋白表達升高（P＜0.05），STAT3活化和Survivin蛋白表達降低（P＜0.05）；與5-Fu組比較，大豆異黃酮組小鼠移植瘤組織STAT3活化和Survivin蛋白表達降低（P＜0.05）。

3 討 論

小鼠H22肝癌移植瘤模型是篩選抗癌化療藥物常用的腫瘤模型[24]。該小鼠移植瘤成瘤率高，腫瘤生長緩慢、穩(wěn)定，肺轉(zhuǎn)移少，是理想的腫瘤模型[25]。本實驗結(jié)果表明，大豆異黃酮抑制小鼠H22移植瘤生長，抑瘤率大于30%，雖然其抑癌作用低于5-Fu，但符合抗腫瘤藥物的要求[26]。

細胞核染色質(zhì)DNA斷裂成180～200 bp或者其多聚體片段是細胞凋亡的生化特征[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮增加小鼠移植瘤細胞凋亡特征性結(jié)構(gòu)——DNA ladder的形成，同時上調(diào)小鼠移植瘤組織Casp-3、Casp-38和Casp-39活性片段的形成，提示大豆異黃酮可促進H22小鼠肝癌移植瘤細胞凋亡。這與本課題組前期研究[5]相一致。

眾所周知，細胞凋亡可通過線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑實現(xiàn)[18]。其中，線粒體途徑是凋亡的主要途徑，又分為依賴Caspase和不依賴Caspase的凋亡途徑[18]。Caspase依賴性凋亡主要為線粒體受損，促使Cyt c釋放到胞漿中，啟動Caspase激活，引起細胞凋亡[18]。而AIF是一種不依賴Caspase的凋亡效應(yīng)分子，細胞受到凋亡刺激后，AIF成熟并從線粒體釋放到胞漿，繼而轉(zhuǎn)位到核內(nèi)作用于DNA，使其發(fā)生片段化，引起不依賴Caspase的凋亡途徑[19-21]。線粒體凋亡途徑激活中，Bcl-2家族成員起重要調(diào)節(jié)作用。其中，Bcl-2為抗凋亡因子，Bax為促凋亡因子，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，兩者的比值決定細胞的存活或死亡[19-21]。本實驗結(jié)果顯示，大豆異黃酮上調(diào)小鼠移植瘤組織胞漿Cyt c和AIF蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白表達，升高Bax/Bcl-2比值。提示大豆異黃酮促細胞凋亡作用至少部分是與Bcl-2家族成員有關(guān)。

Bcl-2家族蛋白表達受多種信號途徑的調(diào)控，其中p53是研究較廣泛的途徑之一，而Bax是第一個被鑒定為受其調(diào)控的Bcl-2家族成員[22]。JAK2/STAT3途徑也是近年來研究較多的一條胞內(nèi)信號通路，涉及細胞增殖、凋亡、分化及炎癥發(fā)生等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[22-23]。研究表明，STAT3可通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl以及凋亡抑制因子Survivin的表達抑制細胞凋亡[27-28]。也有報道稱Survivin可受p53調(diào)控，二者可能共屬于相同信號轉(zhuǎn)導通路中[29-30]。本研究結(jié)果表明，大豆異黃酮上調(diào)p53蛋白表達，下調(diào)STAT3活化和Survivin蛋白表達，提示其促凋亡機制可能與STAT3和p53有關(guān)。

綜上所述，大豆異黃酮可誘導小鼠H22移植瘤細胞凋亡，其促細胞凋亡作用可能與p53和STAT3介導的凋亡途徑有關(guān)。