余 恒,宋光捷

腦梗死是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，發(fā)病率、致殘率、病死率均較高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。腦梗死后遺癥病因復(fù)雜，盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其病理機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但臨床仍缺乏特效治療手段。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞移植療法給腦梗死后遺癥患者帶來(lái)了福音，但仍存在存活不易、穿透瘢痕組織難度大、成瘤性等多種問(wèn)題[2-3]。因此，研究腦梗死損傷機(jī)制，尋找新的有效治療藥物具有迫切性。生姜是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖，具有發(fā)散、止嘔、止咳等功效，且藥理作用廣泛[4]。生姜乙醇或水提取物能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織過(guò)氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)，下調(diào)丙二醛(MDA)表達(dá)，降低大鼠血液纖維蛋白原水平，抑制膽堿酯酶活性，從而有效改善神經(jīng)功能癥狀，提高認(rèn)知、記憶功能。生姜總酚是生姜的主要成分，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等多種含有酚羥基的化學(xué)物質(zhì)[5-8]。本研究旨在探討生姜總酚對(duì)急性腦梗死模型大鼠神經(jīng)功能的作用，以期為腦梗死后遺癥治療提供新的思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1藥物 生姜系獲贈(zèng)于河南省中醫(yī)藥研究院中藥分析實(shí)驗(yàn)室。采用色譜柱分離、高效液相色譜等方法制備生姜總酚。臨用時(shí)采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將生姜總酚制備成0.1%濃度的混懸液。6-姜酚(純度≥98.0%)、8-姜酚(純度≥96.0%)、6-姜烯酚(純度≥98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。采用紫外分光光度法測(cè)定生姜總酚含量，對(duì)照品為6-姜烯酚，波長(zhǎng)為280 nm，測(cè)得生姜總酚含量為95.12%。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性裸大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2015-0002；飼養(yǎng)于我院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境中，溫度(24±2)℃，濕度30%～60%，常規(guī)自由飲食，每天日照12 h，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方式符合動(dòng)物倫理要求。

1.3試劑與儀器 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；一抗為鼠抗Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自北京搏奧森公司；Caspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovison公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組：選取30只環(huán)境適應(yīng)良好的大鼠，進(jìn)行編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、生姜總酚組，每組10只。

1.4.2建立模型：采用經(jīng)典的Longa法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型[9]。模型組與生姜總酚組均經(jīng)腹腔注射30 g/L水合氯醛10 ml/kg，充分顯露左頸動(dòng)脈，按血流走向行頸內(nèi)、外動(dòng)脈分離，對(duì)甲狀腺動(dòng)脈、左側(cè)枕動(dòng)脈予以結(jié)扎處理，在近心端與頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎處相距約1.0 mm位置做一小切口，由開(kāi)口處插入線(xiàn)栓，約19 mm深度，將含線(xiàn)栓的血管進(jìn)行結(jié)扎，再逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后2 h內(nèi)，若見(jiàn)大鼠表現(xiàn)出精神不振，同側(cè)Horner征，而對(duì)側(cè)前肢下垂、內(nèi)旋，并不自主地朝患側(cè)轉(zhuǎn)圈，則表明模型建立成功。若未見(jiàn)該表現(xiàn)，則表明模型建立失敗，予以剔除。術(shù)后2 h行Bederson神經(jīng)功能評(píng)分[10]，對(duì)于評(píng)分為0分或4分者，予以剔除；手術(shù)過(guò)程中出現(xiàn)死亡的大鼠，也予以剔除；剔除大鼠予以重新補(bǔ)充，保證每組10只。假手術(shù)組除不進(jìn)行插入線(xiàn)栓操作外，余同模型組與生姜總酚組。

1.4.3干預(yù)方法：造模后30 min，生姜總酚組予以0.1%生姜總酚混懸液10 ml/kg灌胃，1/d,連續(xù)7 d。假手術(shù)組與模型組予以等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.4.4大鼠神經(jīng)功能評(píng)估：于術(shù)后7 d，對(duì)3組大鼠進(jìn)行Bederson神經(jīng)功能評(píng)分，以評(píng)估神經(jīng)功能缺損情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)功能無(wú)缺陷，0分；右側(cè)前爪不能完全伸展，1分；向患側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；向患側(cè)傾倒，3分；無(wú)法自發(fā)行走、意識(shí)喪失，4分；死亡，5分。

1.4.5檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況：在完成神經(jīng)功能評(píng)估后，將大鼠處死，取出腦組織，以O(shè)CT進(jìn)行包埋，再應(yīng)用冰凍切片機(jī)切成7 μm厚度切片，并置于玻片上。應(yīng)用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：玻片以40 g/L多聚甲醛/磷酸緩沖液固定，并以2 mg/ml蛋白酶K溶液處理，再加入100 μl 1×平衡緩沖液于標(biāo)本區(qū)域，孵育30 min，之后棄液體，將50 μl TdT孵育緩沖液滴于玻片上，置于37℃環(huán)境下，孵育60 min，以磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，然后用濾紙吸干殘留的磷酸緩沖液。熒光顯微鏡下觀(guān)察，分析樣本。隨機(jī)選取梗死灶周?chē)?0個(gè)高倍(×400)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.4.6檢測(cè)大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平：將腦組織放置于液氮中，以研缽研碎，放置在1×上樣緩沖液中，100℃恒溫金屬浴中煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉于37℃下封閉2 h，加一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，然后采用ECL PLUS化學(xué)發(fā)光，得顯影、定影后的X光膠片，并以β-actin作為內(nèi)參。采用quantity one 4.62軟件定量測(cè)定蛋白條帶密度，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平，取3次測(cè)定結(jié)果平均值。

2 結(jié)果

2.1Bederson神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組、模型組和生姜總酚組的Bederson神經(jīng)功能評(píng)分分別為(0.30±0.08)分、(1.98±0.64)分和(1.25±0.37)分。3組大鼠Bederson神經(jīng)功能評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組Bederson神經(jīng)功能評(píng)分高于假手術(shù)組，而生姜總酚組低于模型組(P<0.05)。

2.2腦組織細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組、模型組和生姜總酚組的腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為(7.76±2.13)個(gè)、(35.12±6.23)個(gè)和(27.56±6.47)個(gè)。3組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)目多于假手術(shù)組，而生姜總酚組少于模型組(P<0.05)。3組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞免疫熒光染色顯示，腦組織正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈綠色。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠腦組織免疫熒光染色結(jié)果(×400) A為假手術(shù)組，B為模型組，C為生姜總酚組

2.3腦組織Caspase-3表達(dá)水平 假手術(shù)組、模型組和生姜總酚組腦組織Caspase-3表達(dá)水平分別為0.29±0.08、1.12±0.24和0.63±0.19。3組大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組和生姜總酚組腦組織Caspase-3表達(dá)水平高于假手術(shù)組，而生姜總酚組低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

腦梗死神經(jīng)損傷機(jī)制與康復(fù)治療對(duì)策長(zhǎng)期以來(lái)一直是臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。目前臨床用于腦梗死研究的大鼠模型種類(lèi)較多，包括光化學(xué)法誘導(dǎo)建模、線(xiàn)栓法等。本研究采用線(xiàn)栓法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該模型是利用線(xiàn)栓將動(dòng)脈血管血流阻斷，能夠較真實(shí)地模擬急性腦梗死的發(fā)病過(guò)程，且該建模方式具有操作簡(jiǎn)單、構(gòu)建成功率高、重復(fù)性良好、梗死灶穩(wěn)定等多種優(yōu)勢(shì)，在臨床研究腦缺血疾病的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛[11-13]。

生姜是一種傳統(tǒng)中藥，可行解表散寒、化痰止咳之功，近年來(lái)有關(guān)其對(duì)腦缺血疾病治療作用的研究報(bào)道逐漸增多。研究表明，生姜汁、生姜提取物對(duì)慢性腦缺血、缺血再灌注損傷模型大鼠有治療作用，能夠減少梗死灶體積，改善神經(jīng)癥狀，而其改善腦組織能量代謝、清除氧自由基、抑制鈣超載、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是相關(guān)作用機(jī)制[14]?！吨袊?guó)藥典(2015版)》指出，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等是評(píng)價(jià)生姜質(zhì)量的重要成分[15]。生姜總酚提取自生姜，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[16]。已有研究顯示，生姜總酚能夠減輕大鼠腦缺血損傷，對(duì)神經(jīng)功能有顯著保護(hù)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，生姜總酚組Bederson神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，提示生姜總酚能夠改善腦梗死模型大鼠神經(jīng)功能，具有肯定的神經(jīng)功能保護(hù)作用。

腦梗死后，腦組織神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，從而引起神經(jīng)功能損傷[18-19]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組與生姜多酚組腦組織凋亡細(xì)胞明顯增多，證實(shí)細(xì)胞凋亡是腦梗死后神經(jīng)功能損傷的病理機(jī)制。有研究表明，生姜具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，生姜總酚組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示生姜總酚能夠抑制腦梗死模型大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與既往報(bào)道類(lèi)似。細(xì)胞凋亡指生理、病理狀態(tài)下，機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而出現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡，其受分子水平調(diào)控[21]。Caspases蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，凋亡的最后實(shí)施是通過(guò)Caspases的激活而實(shí)現(xiàn)的，此為凋亡調(diào)控的共同機(jī)制。而Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的主要執(zhí)行者，能夠通過(guò)特異性裂解一系列底物而致細(xì)胞凋亡[22]。為探討生姜總酚抑制腦梗死神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究還采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)了Caspase-3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，生姜總酚組腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示降低腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平可能是生姜總酚抑制腦梗死模型大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

綜上所述，生姜總酚能夠減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷，具有神經(jīng)功能保護(hù)作用，可能是通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)因子Caspase-3表達(dá)，抑制腦組織細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。生姜總酚及相關(guān)作用靶點(diǎn)可為腦梗死治療提供新思路、方法，值得深入研究。