郝新彥，向志光，高 虹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

動物鼻式氣溶膠暴露裝置(nose-only inhalation exposure device)是可模擬產(chǎn)生藥物、毒物等化學(xué)物質(zhì)及病毒、細(xì)菌等病原微生物氣溶膠、氣體或蒸汽的設(shè)備，僅將動物鼻部暴露于設(shè)定環(huán)境中，使動物吸入含有受試物的空氣而達(dá)到定量攻毒感染[1- 3]。鼻式氣溶膠暴露裝置可通過裝有細(xì)菌、病毒等病原微生物懸浮液的霧化器霧化產(chǎn)生微生物氣溶膠，實(shí)驗(yàn)動物吸入氣溶膠后，在感染過程中避免了消化道、皮膚等其他暴露途徑感染，感染方式與自然環(huán)境極為相似[1-9]。為使用動物鼻式氣溶膠暴露裝置進(jìn)行安全有效的病原微生物氣溶膠感染，本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus)MHV-JHM作為模式微生物，分別代表細(xì)菌和病毒，使用此暴露裝置發(fā)生細(xì)菌、病毒氣溶膠，探究裝置能否正常運(yùn)行，同時探討裝置運(yùn)行過程中產(chǎn)生的氣溶膠粒徑大小、裝置氣密性、氣溶膠在暴露艙內(nèi)的分布均勻性及消毒劑對裝置的消毒效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種、病毒：大腸桿菌(有氨芐抗性，Amp+)、鼠肝炎病毒毒株MHV-JHM毒株均引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所。

1.2 主要試劑與儀器

LB固體培養(yǎng)基(Amp+)，LB液體培養(yǎng)基(Amp+)，DMEM無血清高糖培養(yǎng)基，RNA提取試劑盒(TaKaRa，9766，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa，RR064A，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，硝酸纖維素(NC)膜(Millipore，0.45 μm)。ABI 7500 Real-time PCR擴(kuò)增儀(USA)，動物鼻式氣溶膠暴露裝置(美國In-TOX P.O.BOX2070，NM505-832-5107)：動物鼻式氣溶膠暴露裝置主要由潔凈壓縮空氣系統(tǒng)、氣溶膠輸送管路、凈化裝置(真空泵、高效過濾器)、氣溶膠發(fā)生裝置(Lovelace噴霧器、稀釋器、混合器)、48孔鼻式暴露艙、測試動物安置裝置(動物固定管)、采樣裝置(ZR-A02型安德森六級采樣器、In-TOX液體撞擊采樣器)和暴露系統(tǒng)控制柜組成(如圖1所示)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物鼻式氣溶膠暴露裝置產(chǎn)生大腸桿菌氣溶膠

(1)氣溶膠粒徑大小評價(jià)：將6.5 mL 2 × 109CFU/mL大腸桿菌菌液倒入噴霧器小管內(nèi)，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，維持暴露艙微負(fù)壓。設(shè)置裝置在霧化壓力為5, 10, 15, 20, 25 PSI下發(fā)生氣溶膠，安德森六級采樣器在總排氣管路分別采樣20 min。采樣平皿于37℃下培養(yǎng)12 h，評價(jià)在不同壓力下采樣氣溶膠的粒譜分布。將各級采樣平皿采集的氣溶膠顆粒按級別分為6組數(shù)據(jù)，依據(jù)偏態(tài)分布50%中值直徑計(jì)算公式算出發(fā)生氣溶膠總粒子的中值直徑。

(2)氣溶膠到達(dá)暴露艙端口評價(jià)：將6.5 mL 2 × 109CFU/mL大腸桿菌菌液倒入噴霧器小管內(nèi)，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，霧化壓力為20 PSI，采樣流量為2.2 L/min，維持暴露艙微負(fù)壓，以LB液體培養(yǎng)基作為采樣液，液體撞擊采樣器采樣20 min。分別取采樣液1 mL涂于兩個LB固體培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)12 h，觀察采樣平皿上是否有菌落生長，評價(jià)暴露艙端口是否有氣溶膠通過。

(3)氣溶膠分布均勻性評價(jià)：48孔動物鼻式暴露艙共4層，每層間隔3個端口放置一個固定管(如圖2所示)，NC膜(1 cm × 1 cm)置于小鼠固定器前端端口處采樣20 min。將NC膜放于LB固體培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)12 h，觀察NC膜上是否有菌落生長并計(jì)數(shù)，評價(jià)暴露艙各端口是否都有氣溶膠到達(dá)，氣溶膠分布是否均勻。其他參數(shù)設(shè)置同1.3.1中的(2)。

圖1 In-TOX鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)示意圖Figure 1 Schematic figure of the In-TOX nose-only inhalation exposure device

注：圖中(1)～(4)分別為暴露艙的從上至下1～4層，在各層①、②、③暴露口放置小鼠固定器，并用NC膜進(jìn)行采樣。圖2 48孔鼻式暴露艙各層各端口分布圖Note. Figures (1)-(4) are representative of layers 1-4 of the exposure chamber from top to bottom. Animal tubes were placed on port ①, port ②, and port ③ of each layer. The NC membrane placed at the nozzle of animal tubes was used for sampling.Figure 2 Each port of each layer in the 48-port nose-only exposure chamber

(4)裝置氣密性評價(jià)：在進(jìn)行1.3.1中的(1)、(2)、(3)發(fā)生E.coli氣溶膠操作時，在暴露裝置易發(fā)生泄露的6處(霧化器旁、暴露艙上端排氣處、安德森六級采樣器旁、液體撞擊采樣器旁、高效過濾器旁、真空泵旁)擺放沉降平皿，沉降20 min。將沉降平皿于37℃下培養(yǎng)12 h，觀察沉降平皿上是否有菌落生長，評價(jià)暴露裝置是否發(fā)生氣溶膠泄露。

(5)裝置消毒效果評價(jià)：大腸桿菌氣溶膠停止運(yùn)行后，空運(yùn)行系統(tǒng)10 min，以排出含有大腸桿菌氣溶膠的氣體；將8 mL 75%乙醇加入噴霧器小管內(nèi)，系統(tǒng)運(yùn)行30 min進(jìn)行消毒；消毒后空運(yùn)行系統(tǒng)30 min，以排出含有乙醇的空氣。消毒結(jié)束后，空運(yùn)行系統(tǒng)并使用安德森六級采樣器采樣20 min。采樣平皿于37℃下培養(yǎng)12 h，觀察平皿上是否有菌落生長，評價(jià)在裝置產(chǎn)生大腸桿菌氣溶膠后，75%乙醇對裝置的消毒效果。其他參數(shù)設(shè)置同1.3.1中的(2)。

1.3.2 動物鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)產(chǎn)生MHV-JHM氣溶膠

(1)發(fā)生MHV-JHM氣溶膠：取6.5 mL備好的1.5 × 108拷貝數(shù)/mL的MHV-JHM病毒液倒入噴霧器小管內(nèi)，霧化流量為0.6 L/min，稀釋流量為18.3 L/min，排氣流量為20 L/min，霧化壓力為20 PSI，采樣流量為2.2 L/min，維持暴露艙微負(fù)壓，以DMEM無血清高糖培養(yǎng)基為采樣液，液體撞擊采樣器在暴露艙單個端口采樣20 min。收集采樣液進(jìn)行后續(xù)RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴(kuò)增的熒光值[1.3.2中的(4)]。評價(jià)系統(tǒng)是否發(fā)生病毒氣溶膠，及單個暴露艙端口是否有氣溶膠氣流通過。

(2)裝置氣密性評價(jià)：待系統(tǒng)停止氣溶膠發(fā)生后，滅菌棉簽采集易泄露的5處(開放空氣過濾器處、霧化器小管處、液體撞擊采樣器處、暴露艙端口處、暴露艙上端進(jìn)氣管路處)MHV-JHM氣溶膠。將采樣棉簽放于DMEM無血清高糖培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴(kuò)增的熒光值[1.3.2中的(4)]。評價(jià)裝置在運(yùn)行過程中是否發(fā)生氣溶膠泄露。

(3)提取RNA：以DMEM無血清高糖培養(yǎng)基作為陰性對照，使用RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取氣溶膠發(fā)生液、采樣器采樣液及1.3.2第(2)條中所采集樣本的RNA，并于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)一步法RT-PCR擴(kuò)增：病毒MHV-JHM一步法RT-PCR的引物、探針由賽默飛世爾科技(中國)有限公司設(shè)計(jì)并合成，其序列見表1。其中，熒光探針5’端標(biāo)記為FAM，3’端標(biāo)記為BQ1。

以1.3.2第(3)條中提取的RNA為模板，以ddH2O設(shè)置陰性對照，使用一步法RT-PCR試劑盒，應(yīng)用ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如表2所示，共20.0 μL。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋悍崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)(42℃，5 min；95℃，10 s)，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)(95℃，5 s；60℃，34 s)，共40個循環(huán)。進(jìn)行病毒RNA檢測。

(5)裝置消毒效果評價(jià)：病毒氣溶膠停止運(yùn)行后，空運(yùn)行系統(tǒng)10 min，以排出含有病毒氣溶膠的氣體；將6.5 mL 3%過氧化氫溶液加入噴霧器小管內(nèi)，系統(tǒng)運(yùn)行30 min進(jìn)行消毒；消毒后空運(yùn)行系統(tǒng)30 min，以排出含有過氧化氫的空氣。消毒結(jié)束后，空運(yùn)行系統(tǒng)，以DMEM無血清高糖培養(yǎng)基為采樣液，液體撞擊采樣器在暴露艙單個端口采樣20 min。收集采樣液進(jìn)行后續(xù)RNA提取[1.3.2中的(3)]及一步法RT-PCR檢測病毒RNA擴(kuò)增的熒光值[1.3.2中的(4)]，評價(jià)在裝置產(chǎn)生MHV-JHM病毒氣溶膠后，3%過氧化氫溶液對裝置的消毒效果。其他參數(shù)設(shè)置同1.3.2中的(1)。

2 結(jié)果

2.1 氣溶膠粒徑大小評價(jià)結(jié)果

由表3和圖3可知，在霧化壓力為5～25 PSI條件下，安德森六級采樣器所采集的氣溶膠顆粒主要集中分布在5級(1.1～2.1 μm)、6級(0.65～1.1 μm)，中值直徑在(1.27±0.61) μm。提示鼻式氣溶膠暴露裝置能正常運(yùn)行，產(chǎn)生中值直徑為(1.27±0.61) μm氣溶膠顆粒。

2.2 氣溶膠到達(dá)暴露艙端口評價(jià)結(jié)果

液體撞擊采樣器采樣E.coli氣溶膠，取采樣液1 mL分別涂兩平板，培養(yǎng)后兩平板上均有菌落生長，菌落數(shù)分別為64、84。ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)檢測到液體撞擊器采樣樣本中的MHV-JHM RNA為陽性(如圖4所示)。提示裝置能正常運(yùn)行發(fā)生細(xì)菌、病毒氣溶膠，且產(chǎn)生的氣溶膠可以到達(dá)暴露艙端口。

2.3 氣溶膠分布均勻性評價(jià)結(jié)果

NC膜上有菌落生長，菌落數(shù)均在10左右，計(jì)數(shù)結(jié)果如表4所示，暴露艙各端口菌落數(shù)一致。提示產(chǎn)生的氣溶膠均到達(dá)暴露艙各端口，且氣溶膠分布均勻。

表1MHV-JHM病毒RT-PCR擴(kuò)增引物及熒光探針

Table1Primers and fluorescent probes for RT-PCR of MHV-JHM

探針/引物名稱Probe/Primer names序列(5’ → 3’)Sequences (5’ → 3’)MHV-JHM FGGAACTTCTCGTTGGGCATTATACTMHV-JHM RACCACAAGATTATCATTTTCACAACATA探針 ProbeACATGCTACGGCTCGTGTAACCGAACTGT

表2 一步法RT-PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of one-step RT-PCR

表3 安德森六級采樣器捕獲粒徑分布情況及中值直徑結(jié)果Table 3 Particle size distribution and mass median aerodynamic diameter of aerosol sampled by Andersen six-stage sampler

注：中值直徑：P50=L + i/f(50%n - c)，其中，L為中位數(shù)所在組段的下限；i為該組段的組距；f為中位數(shù)所在組段的頻數(shù)；n為總的累積頻數(shù)；c為小于L各組段的累積頻數(shù)。

Note. Mass median aerodynamic diameter (MMAD):P50=L + i/f(50%n - c). In the formula, L: lower limit of group segment with median; i: the group range of the group segment with median; f: frequency of the group segment with median; n: total cumulative frequency; c: cumulative frequency of each group less than L.

注：標(biāo)號1～5：分別是In-TOX動物鼻式氣溶膠暴露系統(tǒng)在霧化壓力為5，10，15，20，25 PSI條件下所產(chǎn)生的E. coli氣溶膠結(jié)果圖。第一行(標(biāo)號1)：1-1至1-6分別是霧化壓力為5 PSI條件下，安德森六級采樣器從1級到6級采樣平皿的菌落數(shù)；第二行至第五行(標(biāo)號2～5)：每行內(nèi)各標(biāo)號與第一行同理，分別是霧化壓力為10，15，20，25 PSI條件下，安德森六級采樣器從1級到6級采樣平皿的菌落數(shù)。圖3 安德森六級采樣器采樣氣溶膠分布結(jié)果Note. Labels 1-5: The distribution of E. coli aerosol sampled by the In-TOX animal nose-only inhalation exposure system under the conditions of 5, 10, 15, 20, and 25 PSI nebulizer pressure. In the first row (label 1), 1-1 to 1-6 represent the numbers of colonies from stage 1 to stage 6 of the Anderson six-class sampler under the condition of 5 PSI nebulizer pressure. For the second to the fifth rows (labels 2-5), equivalent values are presented for nebulizer pressures of 10, 15, 20, and 25 PSI, respectively.Figure 3 The distribution result of aerosol sampled by the Andersen six-stage sampler

注：1：MHV-JHM病毒發(fā)生液；2：液體撞擊器采集MHV-JHM病毒氣溶膠。圖4 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)Note. 1: MHV-JHM virus liquid; 2: MHV-JHM aerosol sampled by liquid impinger.Figure 4 Test of real-time fluorescence quantitative PCR

暴露艙層數(shù)The layer of the exposure chamber暴露艙各層端口 The port of each layer①②③均值Mean1109109.7211101010.3310101110.3410999.3

2.4 裝置氣密性評價(jià)結(jié)果

放置在暴露裝置易發(fā)生泄露部位的6個沉降平板上大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)為0；一步法RT-PCR檢測易泄露處(開放空氣過濾器處、霧化器小管處、液體撞擊采樣器處、暴露艙端口處、暴露艙上端進(jìn)氣管路處)采樣樣本中的病毒RNA為陰性。提示鼻式氣溶膠暴露裝置在發(fā)生氣溶膠過程中未發(fā)生氣溶膠泄露，氣密性良好。

2.5 裝置消毒效果評價(jià)結(jié)果

對系統(tǒng)進(jìn)行消毒后，放置在安德森六級采樣器上的6個采樣平皿上大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)為0；一步法RT-PCR檢測裝置進(jìn)行消毒后的采樣樣本中的病毒RNA為陰性。表明E.coli氣溶膠、MHV-JHM氣溶膠分別在75%乙醇、3%過氧化氫運(yùn)行后可被徹底殺滅，提示使用相應(yīng)的消毒劑可對系統(tǒng)進(jìn)行有效的消毒，消毒效果完全。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌和鼠肝炎病毒分別代表細(xì)菌和病毒發(fā)生氣溶膠，使用安德森六級采樣器、液體撞擊采樣器、NC膜進(jìn)行采樣。安德森六級采樣器采集粒譜范圍廣、采樣效率高、微生物失活率低、敏感性高[10-11]，故采樣平皿培養(yǎng)后的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果明顯；液體撞擊采樣器采樣時間通常為1～10 min時采樣效率較高[12-13]，之前研究表明，采樣流量多設(shè)置為10 L/min左右[11]；但在此鼻式氣溶膠暴露裝置中，液體撞擊采樣器所在采樣管路本身采樣流量小，最大為2.2 L/min，為增加采樣量，實(shí)驗(yàn)中采樣時間長，為20 min，存在微生物粒子撞擊時的損傷、微生物粒子逃逸和再次氣溶膠化、收集介質(zhì)蒸發(fā)等問題，采樣效率低，故采集到的細(xì)菌氣溶膠經(jīng)培養(yǎng)后活菌菌落數(shù)較少[11, 14]。對液體撞擊采樣器采集到的病毒氣溶膠，使用靈敏度高、高效快速的實(shí)時熒光定量RT-PCR法進(jìn)行檢測。本次實(shí)驗(yàn)因NC膜易于裁剪、使用方便，故使用NC膜進(jìn)行采樣；LB液體培養(yǎng)基浸潤的NC膜(1 cm × 1 cm)放在動物固定管噴嘴處，面積較小，且不宜長時間采樣、采樣效率低[11]，故菌落計(jì)數(shù)較少。

對于安德森六級采樣器1級(> 7.0 μm)、2級(4.7～7.0 μm)相當(dāng)于人體的鼻、咽、喉等上呼吸道；3～6級相當(dāng)于人體的下呼吸道：3級(3.3～4.7 μm)相當(dāng)于人體的氣管、支氣管，4級(2.1～3.3 μm)相當(dāng)于人體的二級支氣管，5級(1.1～2.1 μm)相當(dāng)于人體的終末細(xì)支氣管，6級(0.65～1.1 μm)相當(dāng)于人體的肺泡[15]。研究表明，氣溶膠粒子在人體呼吸器官的沉積分節(jié)與其粒子大小有關(guān)，5～10 μm的易沉著于氣管和支氣管，而1～5 μm的粒子可直接侵入肺泡[16-20]。現(xiàn)已評價(jià)In-TOX鼻式氣溶膠暴露裝置能正常運(yùn)行，產(chǎn)生中值直徑為(1.27±0.61) μm的氣溶膠顆粒，顆粒大小可直接侵入肺泡，所發(fā)生的氣溶膠滿足氣溶膠吸入感染實(shí)驗(yàn)的要求；產(chǎn)生的氣溶膠可以到達(dá)且均勻分布到暴露艙各個端口，運(yùn)行過程中未發(fā)生氣溶膠泄露，暴露裝置氣密性良好，使用相應(yīng)的消毒劑可對系統(tǒng)進(jìn)行有效的消毒，消毒效果完全。在實(shí)驗(yàn)過程中，用以發(fā)生氣溶膠的懸浮液用量較少；鼻式暴露艙能同時感染多只動物，安全性、準(zhǔn)確性提高，動物鼻式氣溶膠暴露裝置在微生物氣溶膠感染中受到越來越多的關(guān)注。本研究為動物鼻式氣溶膠暴露裝置安全有效地用于實(shí)驗(yàn)動物高致病性病原微生物氣溶膠的吸入感染研究提供依據(jù)。