閻 濤，胡 萍，徐 晨，王 琪，史丹丹，趙 靜，王宏宇

(南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，南京 211800)

非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠是Makino及其同事繁育出的一種小鼠品系[1-2]，在自身免疫性Ⅰ型糖尿病研究中具有重要作用。分析目前已有的實驗結果，發(fā)現(xiàn)NOD背景小鼠體外受精效率低，每只雌鼠平均可用的二細胞數(shù)量少，而且有資料顯示NOD背景小鼠在體外受精過程中存在發(fā)育遲緩的現(xiàn)象[3]，因此本課題組對現(xiàn)有的實驗操作進行改進，通過對不同周齡鼠體外受精效率的比較以及增加一次二細胞期受精率的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)10周齡的NOD背景雌鼠進行體外受精效率明顯高于其他周齡鼠，這一發(fā)現(xiàn)對NOD背景小鼠體外受精操作具有重要的指導作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

體外受精實驗：4周齡(15～18 g)，6周齡、8周齡、10周齡(20～25 g)的NOD背景雌鼠(數(shù)量見表1、表2)；3～6月齡(30～35 g)NOD背景雄鼠，每次實驗2只共4只。胚胎移植生仔率統(tǒng)計：受體全部采用3月齡(體重為25～35 g)的ICR雌鼠，4周齡、8周齡、10周齡實驗組分別移植55只、40只、30只，共125只。實驗動物(SPF級)全部由南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院提供[SCXK (蘇) 2015-0001]。飼養(yǎng)于南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院屏障環(huán)境動物房(SPF級)[SYXK (蘇) 2015-0001]。所有實驗動物的操作程序均在南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院實驗動物管理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批準下進行(AP號：NRCMM05)。所有實驗動物操作均符合實驗動物的福利倫理，并給予實驗動物人道主義關懷，符合實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

PMSG(孕馬血清雌激素，寧波三生公司)；hCG(人絨毛膜促性腺激素，寧波三生公司)；M16培養(yǎng)液(Sigma公司)用來胚胎培養(yǎng)；HTF培養(yǎng)液用以精子獲能和精卵結合[配制100 mL需要0.5938 g NaCl，0.0350 g KCl，0.0049 g MgSO4·7H2O，0.0054 g KH2PO4，0.0755 g CaCl2，0.210 g NaHCO3，0.050 g葡萄糖，0.34 mL乳酸鈉，0.0037 g丙酮酸鈉，0.0075 g青霉素，0.0050 g鏈霉素，0.40 g BSA，0.04 mL酚紅(0.5%)]。解剖剪；顯微鑷子；Motic體式顯微鏡；熱臺(DB-B1，國華)。

1.3 實驗方法

1.3.1 超排

下午5:30雌鼠經(jīng)腹腔注射PMSG，4周齡雌鼠每只注射5 IU，6周齡雌鼠注射7.5 IU，8、10周齡雌鼠均注射10 IU，48 h后雌鼠經(jīng)腹腔注射hCG，hCG注射劑量同PMSG。

1.3.2 精子獲能

雄鼠脫頸處死，打開腹腔，取出睪丸，分離剪取附睪尾部，用1 mL注射器扎破附睪使精液溢出，將精子轉移到預平衡過的HTF獲能滴中獲能1 h。

1.3.3 取卵

注射hCG 14 h后將雌鼠脫頸處死，分離取出輸卵管，體視顯微鏡在覆蓋礦物油的HTF受精滴中撕開膨大部，使卵團流出，將流出的卵團轉移到受精滴中。

1.3.4 受精

用移液器吸取5～10 μL精子加入含有卵團的受精滴中受精培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.3.5 統(tǒng)計受精率

24 h后統(tǒng)計一細胞、二細胞和異形胚胎數(shù)量，48 h后再統(tǒng)計一次。

1.3.6 移植生仔率

選取本單位日常生產(chǎn)項目中2016—2018年的NOD品系移植生仔數(shù)據(jù)進行比較，觀察不同周齡NOD雌鼠獲得胚胎后移植到ICR雌鼠受體中的生仔率。ICR受體為假孕0.5 d，移植方式為輸卵管移植。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同周齡NOD雌鼠獲得的體外受精二細胞胚胎數(shù)量

兩次實驗，分別統(tǒng)計了24 h和48 h后的實驗結果，結果顯示隨著周齡增加每只小鼠獲得的二細胞胚胎數(shù)呈遞增趨勢， 8周齡每只雌鼠獲得二細胞胚胎數(shù)高于4周齡(P< 0.05)，但是略低于6周齡(P> 0.05)。受精后48 h與24 h相比，二細胞胚胎數(shù)量增多，具體數(shù)據(jù)見表1、表2。

2.2 2016—2018年的NOD品系移植生仔數(shù)據(jù)

不同周齡NOD雌鼠進行體外受精，將得到的胚胎進行移植，4周齡雌鼠獲得的胚胎移植生仔率最低，8周齡雌鼠胚胎移植生仔率高于4周齡，10周齡最高。具體胚胎移植生仔數(shù)據(jù)見表3。

3 討論

由實驗數(shù)據(jù)可以看出NOD背景的小鼠，在4周齡到10周齡范圍內(nèi)隨著雌鼠周齡的增大，每只小鼠獲得的二細胞胚胎數(shù)量先增多，8周齡雌鼠出現(xiàn)降低，10周齡左右的雌鼠進行體外受精(IVF)效果最好。國內(nèi)有研究使用4、8、16周雌鼠進行體外受精實驗，發(fā)現(xiàn)8周齡雌鼠超排效果最差[4]。國外的類似研究也發(fā)現(xiàn)8周齡左右的雌鼠超排量會降低[5]。可能的原因是NOD雌鼠相比其他品系雌鼠性成熟周齡大，7～8周齡才性成熟，性成熟后生殖器官發(fā)育完全，對于超排激素的耐受性增強，由于機體抵抗外源物質的作用使得排卵量不如6周齡，但是8周齡雌鼠由于自身器官機能不如10周齡雌鼠，所以排卵量要低于10周齡雌鼠。

統(tǒng)計歷史移植生仔數(shù)據(jù)，結果顯示隨著雌鼠周齡增加體外受精生產(chǎn)的胚胎移植生仔率升高。移植生仔率是一項波動較大的數(shù)據(jù)，后續(xù)還需要繼續(xù)積累不同周齡雌鼠生產(chǎn)的胚胎移植生仔數(shù)據(jù)，以便通過大數(shù)據(jù)的積累，提供更為有力的證據(jù)。在利用顯微注射方法生產(chǎn)轉基因小鼠時也發(fā)現(xiàn)使用4周齡雌鼠進行體外受精實驗產(chǎn)生的可用胚胎數(shù)量也要少于6～10周齡的雌鼠[6]。

受精后48 h再次統(tǒng)計數(shù)據(jù)的時候可用胚胎數(shù)量增加，但是該觀察結果是否具有研究價值還需要進一步研究，因為48 h的數(shù)據(jù)相比于24 h增加的胚胎數(shù)量不明顯，在實際生產(chǎn)中推廣的意義也不大。對于實際生產(chǎn)，每只雌鼠可用的二細胞胚胎數(shù)量比受精率更有實際意義，所以本文中并未體現(xiàn)受精率的數(shù)據(jù)。目前并未進行48 h后轉化為二細胞胚胎的移植實驗，今后需要增加該種胚胎移植生仔效果實驗，該實驗還可以為是否有必要將胚胎培養(yǎng)至受精后48 h提供重要參考價值。

表1 第一次實驗受精效果數(shù)據(jù)Table 1 In vitro fertilization results of the first experiment

注：4組組間比較：4周齡組和其他三組比較，P< 0.05；10周齡組和其他三組比較，P< 0.05；6周齡組和8周齡組相比，P> 0.05。表2同。

Note. Comparison among four groups: 4-week-old compared with the other three groups,P< 0.05; 10-week-old compared with the other three groups,P< 0.05; and 6-week-old group compared with the 8-week-old group,P> 0.05. The same as in Figure 2.

表2 第二次實驗受精效果數(shù)據(jù)Table 2 In vitro fertilization results of the second experiment

表3 2016—2018年的NOD品系移植生仔數(shù)據(jù)Table 3 Pup birth rate of in vitro-fertilized embryos of NOD mice after transferred into ICR female mice as recipients during 2016-2018

目前針對NOD小鼠體外受精的文獻較少，通過實驗發(fā)現(xiàn)有些NOD背景小鼠的胚胎存在發(fā)育相對遲緩的情況，受精24 h后的觀察結果與受精后48 h的觀察結果不同，主要是一部分畸形的胚胎又轉變?yōu)槎毎咛?，這其中的機制有待于進一步研究。NOD背景小鼠受精卵的原核相對于C57BL/6J小鼠發(fā)育遲緩很多，有研究顯示在體外受精實驗結束后8 h進行顯微注射大部分的受精卵無法發(fā)育到正常形態(tài)的二細胞胚胎，很多都處于形態(tài)異常狀態(tài)，在體外受精15 h后注射后的胚胎才能發(fā)育到不存在形態(tài)異常的二細胞階段[5]。這一研究成果還可以應用到通過顯微注射方法生產(chǎn)轉基因小鼠領域，為了獲得更為高效的注射效果，在通過顯微注射方法生產(chǎn)轉基因小鼠的時候最好延遲注射時間。

目前廣泛應用的小鼠品系如C57BL/6J進行超排的周齡一般為4周齡左右，但是NOD背景小鼠使用4周齡雌鼠進行超排后再進行體外受精實驗的效果很差，受精率低，每只雌鼠可用二細胞胚胎數(shù)量明顯低于平均水平。針對目前NOD背景小鼠可用二細胞胚胎數(shù)量低的情況，本實驗進行了相關研究，并得到了有意義的結果，為今后實際生產(chǎn)提供了有效的指導，在降低生產(chǎn)成本的同時還保證了實驗效率。結果證實10周齡NOD雌鼠進行體外受精效果最好。