陳 濤，王 璇，程 凱，馬恒輝，王婧潔，李漢君，曾慧娟，王璐璐，王少華

0 引 言

乳腺癌已經(jīng)成為女性發(fā)病率最高的腫瘤，且是女性癌癥中的頭號殺手[1-2]。隨著醫(yī)療技術不斷進步，乳腺癌治療技術日漸成熟且多樣化，目前指南推薦的乳腺癌治療方法包括局部治療(手術、放療)，全身治療(輔助/新輔助化療、內分泌治療及分子靶向治療)[3]。然而，對于進展期或轉移性乳腺癌，仍然缺乏顯著有效的治療手段。近年來免疫治療作為一種新興的實體瘤治療方式漸漸成為研究熱點[4]。CD47是一種細胞跨膜蛋白，在人類細胞中廣泛表達。CD47通常作為“別吃我”信號為人們所認知，即表達CD47蛋白的細胞可通過激活吞噬細胞表面的SIRPα信號通路來防止被吞噬。乳腺癌細胞同樣有可能通過表達CD47來逃避免疫監(jiān)視。因此，本研究旨在探索CD47在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況，分析乳腺癌組織CD47的表達與患者臨床特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集收集通過cbioportal網(wǎng)站檢索TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中乳腺浸潤性導管癌數(shù)據(jù)集(2012，Nature)[5-6]，并從該網(wǎng)站下載數(shù)據(jù)集，包括基因數(shù)據(jù)及相關臨床數(shù)據(jù), 分析CD47基因突變及表達變異情況，其中基因數(shù)據(jù)包括4種類型：基因擴增、mRNA上調、mRNA下調、正常拷貝。將基因擴增及mRNA表達上調分為上調組，mRNA下調及正常拷貝者分為正常組，通過Kaplan-Meier分析法分析CD47表達與生存相關性。

1.2病例選取回顧性分析金陵醫(yī)院病理科2011-2015年的乳腺癌病例資料，隨機選取確診為乳腺浸潤性導管癌且術前未接受過治療的185例患者。這些患者的乳腺癌及癌旁組織均經(jīng)“中性甲醛固定-石蠟包埋”方式保存。其中Luminal A型35例，Luminal B型68例，表皮生長因子受體-2(CerbB-2)過表達型28例，三陰性 54例?；颊呔鶠榕?，年齡為25～82歲，中位年齡53歲。對患者采用電話問詢方式進行隨訪，隨訪至2018年3月。

1.3免疫組化正常前列腺腺上皮細胞組織作為陽性對照，前列腺細胞周圍結締組織為陰性對照。兔抗人單克隆抗體抗CD47購自SIGMA公司(稀釋濃度為1∶200)，使用EliVision法進行免疫組化染色。

1.4結果判讀染色結果由2位病理科醫(yī)師采取雙盲法各自判讀，評估浸潤性導管癌細胞及正常乳腺導管腺上皮細胞膜蛋白及細胞質蛋白中CD47的表達情況。判讀采用半定量法：按照染色強度及區(qū)域劃分四個等級，即0～3。細胞無染色為0分，細胞膜弱陽性為1分，超過1/3細胞膜或細胞質染色為2分，細胞膜強陽性染色或超過2/3的細胞膜或細胞質染色為3分[7]。判讀過程中僅評定乳腺腫瘤細胞及正常導管腺上皮細胞，而淋巴細胞、成纖維細胞、巨噬細胞及內皮細胞不計入評定結果。依據(jù)乳腺癌細胞CD47表達情況，將患者分為陰性組及陽性組，免疫組化染色結果判定為0分的為陰性組，1～3分的為陽性組。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件對統(tǒng)計結果進行分析，對評定結果采用二分法進行分組。癌組織及癌旁組織CD47表達結果采用配對χ2檢驗方法進行統(tǒng)計分析，對癌組織CD47表達情況與病理學指標的相關性采用χ2檢驗方法，與生存預后的關系則采用Kaplan-Meier分析法分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TCGA分析檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺浸潤性導管癌共825例樣本，其中CD47基因拷貝數(shù)發(fā)生突變(基因擴增)6例(0.73%)，mRNA表達上調者16例(1.94%)，表達下調者19例(2.30%)，無變異者784例(95.03%)。對這些樣本數(shù)據(jù)進行生存分析，可見上調組中位總生存期為55.6個月，正常組中位總生存期為113.7個月(P=0.0256)。見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中不同CD47基因突變類型乳腺癌患者的生存分析

2.2CD47在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達形態(tài)學特征：鏡下可見乳腺浸潤性導管癌呈實性巢狀或片狀分布，向四周浸潤性推進；腫瘤周圍可見不同程度地分布有淋巴細胞、巨噬細胞等，部分組織可見地圖樣壞死；癌細胞明顯增大呈卵圓形，核質比增加，部分核可見分葉。正常乳腺導管上皮細胞沿乳腺導管內膜規(guī)則均勻分布排列，無核增大或分裂現(xiàn)象。CD47在乳腺癌細胞膜表面及細胞質內表達比例高，染色深，正常乳腺導管上皮細胞染色少見。見圖2。乳腺癌組織CD47陽性表達率為56.21%(104/185)，癌旁組織中陽性表達率為12.97%(24/185)，乳腺癌組織中癌細胞的CD47表達明顯高于正常乳腺上皮細胞(P<0.01)，見表1。

表1乳腺癌組織及癌旁組織CD47表達差異(n=185)

癌旁組織癌組織+-P值+231<0.01-8180

2.3CD47表達與乳腺癌病理學特征相關性185例中，陰性組81例，陽性組104例。通過分析乳腺癌組織中CD47的表達，<45歲乳腺癌患者CD47表達高于年齡≥45歲的乳腺癌患者(68.9%vs52.1%，P<0.05)，提示CD47可能與患者的年齡相關。而CD47在乳腺癌組織中的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移狀態(tài)、Ki-67指數(shù)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)狀態(tài)、臨床分期未見相關。見表2。

2.4生存預后分析185例患者隨訪時間為13～89個月，中位隨訪時間59個月，其中14例失訪，所有患者3年生存率為92.6%，5年生存率為85.7%。3年無病生存率為86.5%，5年無病生存率為82.4%。Kaplan-Meier分析法分析顯示CD47陰性組與陽性組生存未見明顯差異(P>0.05),未發(fā)現(xiàn)患者乳腺癌組織CD47表達與患者生存預后存在顯著相關性。見圖3。

表2乳腺癌組織中CD47表達與臨床病理學特征相關性(n=185)

項目CD47表達量-+P值年齡(歲)0.049 <451431 ≥456773ER狀態(tài)0.291 -3942 +4262PR狀態(tài)0.387 -4855 +3349腫瘤直徑(cm)0.111 <22926 ≥25278淋巴結轉移0.689 無3947 有4257Ki-67指數(shù)?0.181 <202019 >205179Her2表達0.130 -6269 +1935臨床分期0.393 Ⅰ+Ⅱ4868 Ⅲ+Ⅳ3336?Ki-67指標中,有16例患者未行Ki-67檢查

圖2 CD47在乳腺癌及癌旁組織的表達

a：總生存曲線；b：無病總生存曲線圖3 乳腺浸潤性導管癌患者CD47表達與臨床預后

3 討 論

CD47的作用之一是作為樹突細胞及巨噬細胞表面的信號調節(jié)蛋白(signal regulatory protein-α，SIRPα)的配體[8]，通過與SIRPα結合避免被吞噬細胞吞噬。在細胞表面過表達CD47可能是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的一種生存策略。Kaur等[9]發(fā)現(xiàn)一種新型的非SIRPα依賴型的通路，通過這一信號通路，CD47抗體能夠抑制腫瘤干細胞的分化，維持腫瘤細胞干性特征。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在離體實驗中模擬缺氧環(huán)境，腫瘤細胞分泌的缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)能夠促進乳腺癌細胞表達CD47，HIFs和CD47相互協(xié)同下，能夠使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視并維持癌細胞干性特征。Baccelli等[11]在檢測了Luminal A型乳腺癌的CD47表達后，發(fā)現(xiàn)Luminal A型乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞如果CD47和MET基因同時過表達，則患者更容易發(fā)生淋巴結轉移，且生存預后更差。Lo等[12]則發(fā)現(xiàn)，CD47的表達促進了索拉非尼治療小鼠體內肝癌時耐藥的發(fā)生。此外，應用CD47相關抗體治療腫瘤已經(jīng)取得了一定療效，如聯(lián)合CD47抗體及利妥昔單抗，能夠促進吞噬作用并殺滅非霍奇金淋巴細胞[13]。Willingham等[14]發(fā)現(xiàn)在CD47相關抗體的干擾下，多種人類腫瘤在NSG小鼠體內的生長均受到抑制。綜上，乳腺癌細胞的生長、增殖及轉移可能與乳腺癌細胞過表達CD47相關，這提示CD47的過表達與乳腺癌患者預后相關。因此本研究的目的在于研究乳腺癌組織中CD47的表達情況，分析其與乳腺癌患者臨床病理特征及預后的相關性。

盡管CD47在人體正常組織中廣泛表達，但有前期小樣本量研究[15]發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織中CD47陽性率低，而在乳腺癌組織表達陽性率高。本研究共入組了185例，結果表明乳腺癌組織CD47陽性率明顯高于正常組織，與之前的研究一致。而且在年輕乳腺癌患者中(<45歲)，CD47表達率更高，但年輕乳腺癌患者CD47表達上調的機制還有待進一步研究。

CD47在TCGA數(shù)據(jù)中的基因檢測結果與本研究蛋白水平檢測結果存在差異，這提示CD47基因可能在轉錄和翻譯水平上存在調節(jié)因素。例如造血干細胞在穿過富含吞噬細胞的骨竇時，會通過表達CD47來避免被吞噬，當其到達合適位置后，將重新下調CD47的表達[16]。腫瘤抑制基因如miR-133a[17]、miR-192[18]和癌基因MYC都能夠直接與各種腫瘤的CD47啟動子區(qū)域相結合進而調控CD47的表達[19]。同時有研究報道，腫瘤細胞中表達的糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein-78，GRP78)能夠通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)在內質網(wǎng)水平上調CD47的表達[20]。因此還需要進一步探索調節(jié)CD47表達的相關機制。

在TCGA數(shù)據(jù)中，乳腺癌CD47基因擴增或表達上調后對生存的影響有統(tǒng)計學意義，這與部分學者的研究結果一致，提示CD47基因表達變異可以做為乳腺癌患者生存預后分析因素。但本研究中CD47免疫組化檢測結果與臨床預后的相關性并未達到統(tǒng)計學差異，這可能與CD47基因可能在轉錄和翻譯水平上存在調節(jié)因素有關。因此CD47免疫組化結果能否作為乳腺癌患者生存預后的指標仍需要進一步實驗驗證。

事實上，固有免疫僅僅是腫瘤免疫殺傷的一種方式，適應性免疫同樣在腫瘤免疫殺傷中起著重要作用，有研究表明，乳腺癌患者是否出現(xiàn)腋窩淋巴結轉移與腋窩淋巴結淋巴細胞構成比相關[21]。在腫瘤細胞表面還表達有一種程序性死亡蛋白配體(programmed cell death 1 ligand，PD-L1)，通過與殺傷性T淋巴細胞表面的程序性死亡蛋白(programmed cell death 1，PD-1)結合從而抑制T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[22]。Casey等[19]研究發(fā)現(xiàn)MYC基因能夠促進腫瘤細胞表面的PD-L1及CD47表達，進而促進腫瘤的增殖并增強抗腫瘤免疫反應。因此，CD47對于乳腺癌的影響可能不僅僅是單因素的作用，其可能與多種其他免疫因素相互作用，共同調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究僅檢測了乳腺癌組織中CD47的表達，未能得出與病理學指標明顯相關的結論，這有可能是因為樣本量仍然不足引起，也有可能是存在其他與CD47相互作用的因素從而影響了與病理特征的相關性。此外，本研究僅進行了橫斷面研究，未能進行縱向對比研究病程進展時CD47的動態(tài)變化過程。因此CD47的表達在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關機制還需要進一步的實驗來驗證。

由于抗CD47抗體在多種腫瘤的體外試驗中，尤其是治療急性粒細胞性白血病中取得了較好的效果[23]，而且除了發(fā)生貧血外，并不會對其他正常細胞或組織造成明顯影響[14]，目前世界范圍內，已經(jīng)在進行多項關于聯(lián)合CD47單克隆抗體靶向抗腫瘤的臨床試驗。本研究通過大樣本研究了乳腺癌及癌旁組織中CD47的表達，驗證了乳腺癌與癌旁組織中CD47表達存在顯著差異，為進一步研究CD47在乳腺癌免疫逃逸及侵襲轉移中的作用打下了基礎；為研究乳腺癌應用CD47抗體進行靶向治療提供了依據(jù)，也為乳腺癌治療提供了一種新的策略。