劉 東,張 倩,王倩薇,毛英格,王 麗
(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南開封 475001)
近年來,臨床細(xì)菌耐藥問題已嚴(yán)重危及公眾健康,給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。2016年9月5日在中國杭州舉辦了全世界矚目的G20峰會,會中明確提出抗生素耐藥性嚴(yán)重威脅公共健康、經(jīng)濟增長和全球經(jīng)濟穩(wěn)定。而產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是臨床細(xì)菌耐藥的重要原因之一,且CTX-M為主要型別。根據(jù)氨基酸序列的異質(zhì)性,可將其分為6個亞群,即Group 1、Group 2、Group 8、Group 9、Group 25和KLUC Group[1],其中Group 1和Group 9是包含CTX-M型ESBLs變種較多的亞群,也是全世界范圍內(nèi)最主要的流行群。不同亞群間氨基酸變異率大于或等于10%,同一亞群內(nèi)氨基酸變異率小于或等于5%。
表1 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元
-:無數(shù)據(jù)
遺傳證據(jù)顯示,blaCTX-M的初始來源是環(huán)境菌株克呂沃爾菌的染色體,具有豐富的環(huán)境資源,進而傳遞給臨床菌株[1]。blaCTX-M通常位于ISEcp1下游,形成ISEcp1轉(zhuǎn)座單元,或與ISCR1關(guān)聯(lián)位于1型整合子中[2],也有報道顯示blaCTX-M的轉(zhuǎn)移與噬菌體有關(guān)[3]。與blaCTX-M相關(guān)的轉(zhuǎn)座單元或其他元件通常位于質(zhì)粒上,同一菌株可含有1種以上的blaCTX-M,分別位于不同質(zhì)粒上或同一質(zhì)粒的不同位點。ISEcp1屬于IS1380家族,左端重復(fù)序列(inverted repeat left,IRL)和右端重復(fù)序列(inverted repeat right,IRR)長度均為14 bp,二者有兩個堿基差異,編碼420個氨基酸的轉(zhuǎn)座酶(transposase,tnpA)。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的完整結(jié)構(gòu)為:IRL、tnpA、IRR-1和IRR-2。IRR-2與IRL和IRR-1的序列同源性略低,IR的兩端通常會有5 bp正向重復(fù)序列(direct repeat;target site duplication signals for transposition,DR)[4]。ISEcp1可借助IRL和IRR-2轉(zhuǎn)移其臨近的DNA序列,且該DNA序列往往包含耐藥基因[5],blaCTX-M就是其中較為常見的一種[6]。該轉(zhuǎn)座方式大大促進了blaCTX-M的水平轉(zhuǎn)移,進一步促進了其在全球范圍內(nèi)的播散。產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌引發(fā)的耐藥現(xiàn)象已嚴(yán)重危及公眾健康,且CTM-M為主要類型,因此開展CTX-M型ESBLs相關(guān)的分子耐藥機制方面的研究,具有很大的必要性。本文主要從ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的類型及其轉(zhuǎn)座機制兩個方面進行研究,以期為臨床防控和治療提供分子依據(jù)。
1.1分析工具 NCBI網(wǎng)站BLASTN/BLASTP,ResFinder,ISfinder,Inkscape 0.48.1等生物信息學(xué)工具或數(shù)據(jù)庫。
1.2方法 截取ISEcp1和blaCTX-M的序列(二者均有亞型,亞型間同源性較高,選取質(zhì)粒p112298-KPC[7]中相應(yīng)的ISEcp1和blaCTX-M序列),在NCBI網(wǎng)站BLAST入口提交檢索與該序列相似的序列,篩選不同種類的側(cè)翼序列。通過ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)預(yù)測耐藥基因,BLASTN/BLASTP等對ORF和假基因進行核實與信息完善,并利用ISfinder(https://www-is.biotoul.fr/)對移動元件進行精細(xì)注釋,最后運用Inkscape 0.48.1(https://inkscape.org/en/)繪圖。
2.1GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元匯總 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的相關(guān)信息,見表1。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元主要可分為6類,即ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-1G、blaCTX-M-25G和雜合體)、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-1G)、ISEcp1-blaCTX-M-orf3轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M-orfX轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-25G)和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222轉(zhuǎn)座單元(常見于blaCTX-M-9G)。
箭頭:基因;基因、移動元件和其他特征根據(jù)功能分類進行著色;序列兩端的黑色長條:檢索到的序列不完整;陰影:同源性區(qū)域(>95%核苷酸一致性)
圖1 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元繪圖及比對
2.2GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元繪圖及比對 通過對6類ISEcp1轉(zhuǎn)座單元進行精細(xì)結(jié)構(gòu)分析及繪制圖譜,分別得到了相應(yīng)的結(jié)構(gòu)圖,見圖1。完整的ISEcp1轉(zhuǎn)座單元包含IRL、IRR-1和IRR-2,且在IRL和IRR-2的兩端通常會有DR。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元為例(圖1a),其轉(zhuǎn)座單元的線性結(jié)構(gòu)為DR-IRL-tnpA-IRR-1-blaCTX-M-Δorf477-IRR-2-DR,其中上游tnpA為轉(zhuǎn)座酶編碼基因,下游為截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)。另5種轉(zhuǎn)座單元的結(jié)構(gòu)的5′端均與ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元相同,彼此間的差異僅在于blaCTX-M下游,ISEcp1捕獲了不同的基因,形成了不同的結(jié)構(gòu)。
2.3ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元間距示意圖 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型,分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp,見圖2。
圖2 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距(spacer)示意圖
自β-內(nèi)酰胺類抗生素廣泛應(yīng)用于臨床以來,β-內(nèi)酰胺酶陸續(xù)被報道,且其種類逐年增加。其中ESBLs主要是由革蘭陰性桿菌在超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素的選擇壓力下產(chǎn)生的一種β-內(nèi)酰胺鈍化酶,具有廣泛的水解酶活性[8]。目前ESBLs已廣泛存在于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、腸道沙門菌及其他腸桿菌科菌中[9]。ESBLs種類很多,20世紀(jì)60年代,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs,即TEM-1[10];另一個較為常見的質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs是SHV-1,自此TEM-1、SHV-1及其變種開始在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播。1989年德國首次報道了CTX-M-1[11],之后CTX-M型ESBLs迅速在全球范圍內(nèi)傳播,成為目前ESBLs流行中最常見且傳播最廣的類型。
ISEcp1轉(zhuǎn)座單元是blaCTX-M傳播的重要載體,本研究顯示,ISEcp1轉(zhuǎn)座單元結(jié)構(gòu)主要可分為6類,即:ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN、ISEcp1-blaCTX-M、ISEcp1-blaCTX-M-orf3、ISEcp1-blaCTX-M-orfX和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222。最常見的ISEcp1-blaCTX-M-orf477轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M的下游是截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)[12-14]。另一種較為常見的轉(zhuǎn)座單元是ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉(zhuǎn)座單元,即在blaCTX-M的下游為IS903和iroN(編碼鐵外膜轉(zhuǎn)運蛋白)[7,15]。ISEcp1-blaCTX-M轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-2的下游有一段256 bp的序列,該序列和抗壞血酸克呂沃爾菌中kluA-1下游堿基一致[16]。ISEcp1-blaCTX-M-16-orf3轉(zhuǎn)座單元,在blaCTX-M-16的下游為orf3(編碼一種功能未知的蛋白)[17]。ISEcp1-blaCTX-M-26-orfX轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-26的下游是orfX(289 bp,該序列不完整)[18]。ISEcp1-blaCTX-M-14b-ΔIS26-orf222轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-14b的下游有108 bp的IS26殘留和orf222(編碼一種功能未知的蛋白)[19]。
完整的轉(zhuǎn)座單元通常會在IRL和IRR-2的兩端形成5 bp DR,如TACTA、TAATA、AATAC等,是轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的標(biāo)志。該轉(zhuǎn)座方式促進了blaCTX-M的高水平表達和跨種屬、跨物種和跨地區(qū)傳播。細(xì)菌中基因的表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上,啟動子在該過程中居于關(guān)鍵地位,決定相應(yīng)蛋白的表達水平。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元中blaCTX-M的高水平表達與ISEcp1中的啟動子(P1)密切相關(guān),此外還和ISEcp1與blaCTX-M的間距(spacer)有關(guān)[20-21]。本研究顯示,ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型,分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp。研究表明,不同間距包含的啟動子類型和效應(yīng)是不同的[20-21]。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元為例,ISEcp1與blaCTX-M的間距為37~127 bp。不同間距的轉(zhuǎn)座單元均包含P1,有完整的-35區(qū)、-10區(qū)、-35區(qū)和-10區(qū)之間的間隔序列和轉(zhuǎn)錄起始位點,促進下游blaCTX-M的表達。但僅79、80和127 bp間距的轉(zhuǎn)座單元具有P2活性,其他間距的轉(zhuǎn)座單元中由于不同長度的堿基缺失,導(dǎo)致P2中-35區(qū)的缺失,進而影響P2活性[22]。與P2相比,P1活性較強,為強啟動子,在促進下游基因的表達中占據(jù)主導(dǎo)地位[23]。綜合來說,P1活性和短間距是促進下游blaCTX-M高水平表達的關(guān)鍵因素。
blaCTX-M的表達存在“基因沉默”現(xiàn)象,當(dāng)僅有blaCTX-M存在時,該基因不表達或表達水平較低。在外界藥物的壓力下,ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游,為其提供強啟動子區(qū),可促進blaCTX-M的高水平表達,進而使得菌株獲得相應(yīng)耐藥表型[24]。且一旦ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游形成完整的轉(zhuǎn)座單元,便可在不同的遺傳物質(zhì)間傳播,從染色體到質(zhì)粒,質(zhì)粒與質(zhì)粒之間,進而在同種或不同種細(xì)菌間快速傳播,導(dǎo)致耐藥性播散。