黃昌釗，王銳英△，胡譯文

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.四肢創(chuàng)傷骨外科；2.脊柱骨病外科，廣西桂林 541001)

失神經(jīng)化廢用性骨質(zhì)疏松是由于肢體骨骼肌肉失神經(jīng)化營養(yǎng)支配后，因其活動(dòng)長時(shí)間受限或不能，外界應(yīng)力對骨的刺激減少或消失導(dǎo)致骨量丟失、骨脆性增加及骨組織微結(jié)構(gòu)病變的一種局部或全身的骨質(zhì)疏松[1]。本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)干預(yù)致臂叢神經(jīng)根性損傷從而造成大白兔左側(cè)肢體廢用，構(gòu)建廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。在造模后3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對其骨密度、干重、力學(xué)性能及骨組織微結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行評價(jià)，為失神經(jīng)化廢用性骨質(zhì)疏松的研究提供實(shí)驗(yàn)載體。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8個(gè)月齡雄性新西蘭長耳白兔(由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)24只，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，置于室內(nèi)寬敞不銹鋼圈籠中(4.5 m×3.5 m×4.8 m)，保證動(dòng)物籠內(nèi)自由活動(dòng)。在圈籠四角放置充足飼料與水，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由活動(dòng)時(shí)能尋到足夠食物，飼料由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飲用水為日常使用的自來水?？刂剖覝赜?26±3)℃，濕度50%～60%，定期84消毒液及紫外線室內(nèi)消毒排風(fēng)，確保12 h足夠的光照，晝夜交替，適應(yīng)喂養(yǎng)1星期。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制作與分組 1周后，予以水合氯醛(360 mg/kg)兔耳緣靜脈注射，麻醉成功后，取大白兔仰臥位，頭部及四肢分別用繃帶固定于特制兔手術(shù)臺(tái)邊緣，脫毛機(jī)脫毛術(shù)野及周圍皮膚，常規(guī)聚維酮碘消毒，鋪單，取左下頜骨經(jīng)頸向下至胸大肌中部連線中后2/3皮膚切口，顯露胸大肌，分別切斷胸大肌、胸小肌，暴露左鎖骨，于鎖骨下鏡下分離全臂叢神經(jīng)至神經(jīng)根孔處切斷并向遠(yuǎn)端游離約2 cm切斷后曠置，按解剖層次縫合術(shù)口。為預(yù)防縫合口感染，術(shù)后給予各組80萬U青霉素肌內(nèi)注射，1次/天，連續(xù)應(yīng)用3 d，同時(shí)每日予以傷口換藥1次，從而建立大白兔左側(cè)臂叢根性損傷模型。根據(jù)術(shù)后第4、8、12周3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)將24只新西蘭大白兔分為3組(每組8只)。繼續(xù)圈籠內(nèi)放養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.2.2標(biāo)本獲取 分別于術(shù)后第4、8、12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用耳緣靜脈快速注射空氣栓塞法各處死8只兔。仔細(xì)解剖雙側(cè)肱骨，浮力法測量體積，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.3肱骨生物力學(xué)性能測定 取實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)肱骨試件,游標(biāo)卡尺測量長度和直徑。試件兩端樹脂包埋固定，維持試件豎直,包埋深淺均勻一致,保證自凝樹脂基托與試驗(yàn)機(jī)接觸面水平光滑。為避免收集三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)時(shí)碎裂的骨組織及實(shí)驗(yàn)過程中試件干燥，采用薄塑料紙包裹試件。固定好的試件于WDW-20型天辰電子萬能試驗(yàn)機(jī)上行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。測量彎曲強(qiáng)度極限值，以最大載荷及彈性模量衡量骨強(qiáng)度。壓力加載速率是2 mm/min[2-3]。將兩端固定好的肱骨置于力學(xué)試驗(yàn)機(jī)楔形支架上，肱骨凹側(cè)面朝上，壓力桿由上向下勻速對肱骨中段施加壓力，直至試件斷裂。用與力學(xué)試驗(yàn)機(jī)連接的計(jì)算機(jī)記錄整個(gè)測試過程，結(jié)果根據(jù)各組所測骨強(qiáng)度指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4骨密度測定 采用雙能X射線骨密度儀(法國MEDILINK公司)測量不同時(shí)間段各組大白兔雙側(cè)肱骨骨密度值，檢測時(shí)先縱向掃描,顯示肱骨近端形態(tài)后,以骨骺線為參照移3.0 mm和12.0 mm處作斷層測定[4]。

1.2.5骨骼重量測定 留取雙側(cè)肱骨，剔凈附著于骨質(zhì)的軟組織，將肱骨全長標(biāo)本放入烤箱，110 ℃干燥10 h后，用分析天平(精度為0.00 01 g)精確稱取肱骨干重。

1.2.6骨組織形態(tài)學(xué)檢測 取各組雙側(cè)肱骨近端干骺端，10%中性甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣，行骨標(biāo)本冠狀面對剖，乙醇順濃度梯度脫水，組織浸蠟及石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片，行HE和Masson染色，觀察骨組織形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1骨密度 術(shù)后右對照側(cè)與左實(shí)驗(yàn)側(cè)相比，4、8、12周兔肱骨骨密度值分別由0.69、0.68、0.66 g/cm2降至0.47、0.31、0.19 g/cm2，骨密度值隨著肢體廢用時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)側(cè)下降程度明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2肱骨干重 術(shù)后3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)測定兔肱骨全長骨骼干重，左實(shí)驗(yàn)側(cè)與右對照側(cè)比較，肱骨干重值降低，且下降程度隨肢體廢用時(shí)間的延長而加重(P<0.05)。術(shù)后各實(shí)驗(yàn)側(cè)組間值相比較，肱骨失神經(jīng)化支配時(shí)間越長，骨骼干重值下降程度越顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各對照側(cè)組間比較，肱骨干重值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大白兔雙側(cè)肱骨骨骼干重值的測定結(jié)果

2.3骨力學(xué)強(qiáng)度 術(shù)后第4、8、12周實(shí)驗(yàn)側(cè)與對照側(cè)相比，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨力學(xué)強(qiáng)度指標(biāo)與對照側(cè)相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)側(cè)組間比較，骨質(zhì)失神經(jīng)化支配時(shí)間越長，上述各變量值下降程度越顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后各對照側(cè)組間比較，骨強(qiáng)度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3。

表2 各時(shí)間點(diǎn)大白兔肱骨彎曲實(shí)驗(yàn)最大載荷、彈性模量及彎曲強(qiáng)度值測試結(jié)果

表3 各時(shí)間點(diǎn)大白兔肱骨彎曲實(shí)驗(yàn)彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變值測試結(jié)果

圖1 術(shù)后第4、8、12周各組兔肱骨近端干骺端形態(tài)學(xué)變化(HE×100)

圖2 術(shù)后第4、8、12周各組兔肱骨近端干骺端新生膠原變化(Masson×100)

2.4肱骨組織形態(tài)學(xué)檢測 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)對照側(cè)肱骨近端干骺端骨小梁連接緊密，粗大無斷裂，孔隙較少，髓腔及破骨細(xì)胞數(shù)目無異常增多，骨皮質(zhì)較厚，與對照側(cè)組織表現(xiàn)一致(圖1)。相比各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)側(cè)骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、纖細(xì)并存在多處斷裂，小梁間吻合程度明顯降低，髓腔容積擴(kuò)大，破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且隨著觀察時(shí)間的延長，上述表現(xiàn)越發(fā)明顯(圖1)。為評價(jià)骨組織成熟程度，Masson染色顯微鏡下見新生骨膠原大多被染藍(lán)色，成熟骨膠原為鮮紅色，結(jié)果可見隨著兔左上肢廢用時(shí)間的延長，骨質(zhì)中新生膠原的量明顯在減少，成熟膠原量增多(圖2)。

3 討 論

目前臂叢神經(jīng)損傷及廢用性骨質(zhì)疏松患者在臨床診療過程中十分常見，臨床上廢用性骨質(zhì)疏松也常常繼發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓或周圍神經(jīng)病變或損傷后引起的肌肉癱瘓[5-7]，本研究通過手術(shù)構(gòu)建臂叢根性損傷模型致大白兔左上肢廢用，從而打亂其體內(nèi)骨形成和骨吸收動(dòng)態(tài)平衡，有研究報(bào)道新生骨合成需要成骨細(xì)胞介導(dǎo)，骨吸收則依賴于破骨細(xì)胞，此骨吸收大于骨形成動(dòng)態(tài)平衡的紊亂，導(dǎo)致骨質(zhì)發(fā)生疏松病變[8-9]。此外，COUPAUD等[10]指出基于人體四肢骨骼中含有極多的神經(jīng)纖維，神經(jīng)損傷后喪失了對骨骼的調(diào)節(jié)功能，骨組織細(xì)胞功能表達(dá)及骨重塑平衡紊亂，極易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨生成減少，而破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)，導(dǎo)致上肢骨骨質(zhì)的密度、干重、強(qiáng)度、力學(xué)性能及組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)均隨著廢用時(shí)間延長發(fā)生不同程度病變，骨折發(fā)生率顯著提高[11]。這些指標(biāo)的改變表明失神經(jīng)化廢用性骨質(zhì)疏松的兔模型建立成功。

臨床實(shí)驗(yàn)研究中復(fù)制失神經(jīng)化廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型所采取的動(dòng)物及方式多樣，其中以兔及鼠備受青睞[12]。TROSS等[13]指出8個(gè)月齡左右的大白兔其體內(nèi)二級松質(zhì)骨的骨骼重建與人類的骨重建特別相似。因此，為了能更好地了解廢用性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用大白兔為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪呛侠砀咝У摹Ｅc其他的廢用性骨質(zhì)疏松模型比較，失神經(jīng)營養(yǎng)化廢用引發(fā)的局部骨質(zhì)疏松在臨床表現(xiàn)及病理生理機(jī)制上更突出，其導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失起因于骨吸收能力的過表達(dá)和骨形成能力的減弱[14]。

ZENG等[15]報(bào)道了失神經(jīng)化支配后骨生成明顯下降，骨吸收增加，骨量丟失在造模術(shù)后第4～6周開始發(fā)生顯著性廢用性骨質(zhì)疏松，并在 X 線片上有明顯反映。但有大量研究發(fā)現(xiàn)采用大白兔失神經(jīng)造模后，骨質(zhì)發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松的時(shí)間段并不是一致的，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飲食、睡眠、活動(dòng)情況及身體營養(yǎng)狀況等個(gè)體因素相關(guān)。同時(shí)，失神經(jīng)化導(dǎo)致廢用性骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制復(fù)雜，骨骼失神經(jīng)化后打亂體內(nèi)骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡只是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一，其骨動(dòng)態(tài)平衡中相關(guān)蛋白和生化因子的分子變化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)合了臨床臂叢神經(jīng)損傷機(jī)理及解剖結(jié)構(gòu)，采用一側(cè)兔臂叢神經(jīng)根性切斷造模方法。結(jié)果表明，肱骨失神經(jīng)化營養(yǎng)支配后，骨密度、干重明顯降低，骨的力學(xué)強(qiáng)度指標(biāo)較對照側(cè)明顯減弱，骨小梁致密度、小梁間吻合、骨皮質(zhì)厚度、孔隙、髓腔、破骨細(xì)胞數(shù)目及新生膠原纖維數(shù)量在不同的廢用時(shí)間點(diǎn)與對照側(cè)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本研究結(jié)果顯示，臂叢神經(jīng)切斷術(shù)是有效建立廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的方法，為廢用性骨質(zhì)疏松研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)載體，也為骨科今后對骨質(zhì)失神經(jīng)營養(yǎng)方面的基礎(chǔ)研究及臨床防治提供了較為穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。